Fragile X syndrome (FXS) is a multi-organ disease that leads to mental retardation, macro-orchidism in males and premature ovarian insufficiency in female carriers. FXS is also a prominent monogenic disease associated with autism spectrum disorders (ASDs). FXS is typically caused by the loss of fragile X mental retardation 1 (FMR1) expression, which codes for the RNA-binding protein FMRP. Here we report the discovery of distinct RNA-recognition elements that correspond to the two independent RNA-binding domains of FMRP, in addition to the binding sites within the messenger RNA targets for wild-type and I304N mutant FMRP isoforms and the FMRP paralogues FXR1P and FXR2P (also known as FXR1 and FXR2). RNA-recognition-element frequency, ratio and distribution determine target mRNA association with FMRP. Among highly enriched targets, we identify many genes involved in ASD and show that FMRP affects their protein levels in human cell culture, mouse ovaries and human brain. Notably, we discovered that these targets are also dysregulated in Fmr1−/− mouse ovaries showing signs of premature follicular overdevelopment. These results indicate that FMRP targets share signalling pathways across different cellular contexts. As the importance of signalling pathways in both FXS and ASD is becoming increasingly apparent, our results provide a ranked list of genes as basis for the pursuit of new therapeutic targets for these neurological disorders. RNA-recognition elements are identified for the fragile-X-syndrome-associated RNA-binding protein FMRP, in addition to its target messenger RNAs; although many of FMRP gene targets discovered are involved in brain function and autism spectrum disorder, a proportion are also dysregulated in mouse ovaries, suggesting cross-regulation of signalling pathways in different tissues. Fragile X syndrome (FXS) is caused by mutations in the FMR1 gene, which encodes an RNA-binding protein called FMRP. This study from Thomas Tuschl's laboratory has now defined, on a genome-wide level, the targets bound by FMRP and by a disease-associated mutated version of FMRP. Although many of the top targets are involved in brain function and autism spectrum disorder, a surprising number of targets are also dysregulated in mouse ovaries, suggesting cross-regulation of signalling pathways in different tissues.

Abstract Cells rapidly remodel their proteomes to align their cellular metabolism to environmental conditions. Ubiquitin E3 ligases enable this response, by facilitating rapid and reversible changes to protein stability, localization, or interaction partners. In S. cerevisiae , the GID E3 ligase regulates the switch from gluconeogenic to glycolytic conditions through induction and incorporation of the substrate receptor subunit Gid4, which promotes the degradation of gluconeogenic enzymes. Here, we show an alternative substrate receptor, Gid10, which is induced in response to changes in temperature, osmolarity and nutrient availability, and regulates the ART-Rsp5 pathway. Art2 levels are elevated upon GID10 deletion, a crystal structure shows the basis for Gid10-Art2 interactions, and Gid10 directs a GID E3 ligase complex to ubiquitinate Art2. We also find that the GID E3 ligase affects the flux of plasma membrane nutrient transporters during heat stress. The data reveal GID as a system of E3 ligases with metabolic regulatory functions outside of glycolysis and gluconeogenesis, controlled by distinct stress-specific substrate receptors.

SUMMARY To achieve precise cellular regulation, E3 ubiquitin ligases must be configured to match substrate quaternary structures. Here, by studying the yeast GID complex, mutation of which is G lucose- I nduced D egradation deficient, we discover supramolecular chelate assembly as an E3 ligase strategy for targeting an oligomeric substrate. Cryo EM structures show that to bind the tetrameric substrate fructose-1,6-bisphosphatase (Fbp1), two otherwise functional GID E3s assemble into a 20-protein Chelator-GID SR4 , which resembles an organometallic supramolecular chelate. The Chelator-GID SR4 assembly avidly binds multiple Fbp1 degrons and positions Fbp1 so that its protomers are simultaneously ubiquitylated at lysines near its allosteric and substrate binding sites. Significantly, key structural and biochemical features -including capacity for supramolecular assembly - are preserved in the human ortholog, the CTLH E3. Based on our integrative structural, biochemical and cell biological data, we propose that higher-order E3 ligase assembly generally underlies multipronged targeting, capable of simultaneously incapacitating multiple protomers and functionalities of oligomeric substrates.

Cells respond to environmental changes by toggling metabolic pathways, preparing for homeostasis, and anticipating future stresses. For example, in Saccharomyces cerevisiae, carbon stress-induced gluconeogenesis is terminated upon glucose availability, a process that involves the multiprotein E3 ligase, GIDSR4, recruiting N-termini and catalyzing ubiquitylation of gluconeogenic enzymes. Here, genetics, biochemistry, and cryo electron microscopy define molecular underpinnings of glucose-induced degradation. Unexpectedly, carbon stress induces an inactive anticipatory complex (GIDAnt), which awaits a glucose-induced substrate receptor to form the active GIDSR4. Meanwhile, other environmental perturbations elicit production of an alternative substrate receptor assembling into a related E3 ligase complex. The intricate structure of GIDAnt enables anticipating and ultimately binding various N-degron targeting (i.e. "N-end rule") substrate receptors, while the GIDSR4 E3 forms a clamp-like structure juxtaposing substrate lysines with the ubiquitylation active site. The data reveal evolutionarily conserved GID complexes as a family of multisubunit E3 ubiquitin ligases responsive to extracellular stimuli.

ABSTRACT Yeast Saccharomyces cerevisiae is a powerful model system for systems-wide biology screens and large-scale proteomics methods. Nearly complete proteomics coverage has been achieved owing to advances in mass spectrometry. However, it remains challenging to scale this technology for rapid and high-throughput analysis of the yeast proteome to investigate biological pathways on a global scale. Here we describe a systems biology workflow employing plate-based sample preparation and rapid, single-run data independent mass spectrometry analysis (DIA). Our approach is straightforward, easy to implement and enables quantitative profiling and comparisons of hundreds of nearly complete yeast proteomes in only a few days. We evaluate its capability by characterizing changes in the yeast proteome in response to environmental perturbations, identifying distinct responses to each of them, and providing a comprehensive resource of these responses. Apart from rapidly recapitulating previously observed responses, we characterized carbon source dependent regulation of the GID E3 ligase, an important regulator of cellular metabolism during the switch between gluconeogenic and glycolytic growth conditions. This unveiled new regulatory targets of the GID ligase during a metabolic switch. Our comprehensive yeast system read-out pinpointed effects of a single deletion or point mutation in the GID complex on the global proteome, allowing the identification and validation novel targets of the GID E3 ligase. Moreover, our approach allowed the identification of targets from multiple cellular pathways that display distinct patterns of regulation. Although developed in yeast, rapid whole proteome-based readouts can serve as comprehensive systems-level assay in all cellular systems.