Abstract Cell differentiation requires the integration of two opposite processes, a stabilizing cellular memory, especially at the transcriptional scale, and a burst of gene expression variability which follows the differentiation induction. Therefore, the actual capacity of a cell to undergo phenotypic change during a differentiation process relies upon a modification in this balance which favors change-inducing gene expression variability. However, there are no experimental data providing insight on how fast the transcriptomes of identical cells would diverge on the scale of the very first two cell divisions during the differentiation process. In order to quantitatively address this question, we developed different experimental methods to recover the transcriptomes of related cells, after one and two divisions, while preserving the information about their lineage at the scale of a single cell division. We analyzed the transcriptomes of related cells from two differentiation biological systems (human CD34+ cells and T2EC chicken primary erythrocytic progenitors) using two different single-cell transcriptomics technologies (sc-RT-qPCR and scRNA-seq). We identified that the gene transcription profiles of differentiating sister-cells are more similar to each-other than to those of non related cells of the same type, sharing the same environment and undergoing similar biological processes. More importantly, we observed greater discrepancies between differentiating sister-cells than between self-renewing sister-cells. Furthermore, a continuous increase in this divergence from first generation to second generation was observed when comparing differentiating cousin-cells to self renewing cousin-cells. Our results are in favor of a continuous and gradual erasure of transcriptional memory during the differentiation process.

Abstract According to Waddington’s epigenetic landscape concept, the differentiation process can be illustrated by a cell akin to a ball rolling down from the top of a hill (proliferation state) and crossing furrows before stopping in basins or “attractor states” to reach its stable differentiated state. However, it is now clear that some committed cells can retain a certain degree of plasticity and reacquire phenotypical characteristics of a more pluripotent cell state. In line with this dynamic model, we have previously shown that differentiating cells (chicken erythrocytic progenitors (T2EC)) retain for 24 hours the ability to self-renew when transferred back in self-renewal conditions. Despite those intriguing and promising results, the underlying molecular state of those “reverting” cells remains unexplored. The aim of the present study was therefore to molecularly characterize the T2EC reversion process by combining advanced statistical tools to make the most of single cell transcriptomic data. For this purpose, T2EC, initially maintained in a self-renewal medium (0H), were induced to differentiate for 24h (24H differentiating cells); then a part of these cells was transferred back to the self-renewal medium (48H reverting cells) and the other part was maintained in the differentiation medium for another 24h (48H differentiating cells). For each time point, cell transcriptomes were generated using scRT-qPCR and scRNAseq. Our results showed a strong overlap between 0H and 48H reverting cells when applying dimensional reduction. Moreover, the statistical comparison of cell distributions and differential expression analysis indicated no significant differences between these two cell groups. Interestingly, gene pattern distributions highlighted that, while 48H reverting cells have gene expression pattern more similar to 0H cells, they retained traces of their engagement in the differentiation process. Finally, Sparse PLS analysis showed that only the expression of 3 genes discriminates 48H reverting and 0H cells. Altogether, we show that reverting cells return to an earlier molecular state almost identical to undifferentiated cells and demonstrate a previously undocumented physiological and molecular plasticity during the differentiation process, which most likely results from the dynamic behavior of the underlying molecular network.

It has been suggested that a switch from glycolysis, with lactate production, toward mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) could be a driving force during stem cell differentiation. Based upon initial results, from our previous work, showing a drop in LDHA mRNA level during the differentiation of chicken erythroid progenitors, we studied metabolism behavior to question whether such switch might also be operating in those cells. We first analyzed the level of 9 enzymes, including LDHA, involved either in glycolysis or OXPHOS, in self-renewing and differentiating cells. Our results suggest that erythroid differentiation might be accompanied by an enhancement of the respiratory chains and glycolysis activities at 12h, followed by a strong decline of the glycolytic pathway and a stabilization of OXPHOS. To confirm that OXPHOS might be increased and glycolysis decreased during erythroid differentiation, we measured lactate concentration and mitochondrial membrane potential (MMP) of self-renewing and differentiating cells. Our findings show that at 12h-24h of differentiation, a surge of energy is needed, which could be fueled jointly by glycolysis and OXPHOS. Then the energy demand comes back to normal and might be supplied by OXPHOS instead of lactate production through glycolysis. These results support the hypothesis that erythroid differentiation is associated with a metabolic switch from glycolysis to OXPHOS. We also assessed LDHA role in erythroid progenitors self-renewal and the metabolic status changes. Inhibition experiments showed that LDHA activity could be involved in the maintenance of erythroid progenitors self-renewal, and its decline could influence their metabolic status. Finally, we investigated whether these metabolic rearrangements were necessary for erythroid differentiation. The addition of an inhibitor of the respiratory chains affected progenitors ability to differentiate, suggesting that the metabolic switch from glycolysis toward OXPHOS might act as a driving force for erythroid differentiation.