To elucidate differential roles of mutations in myelodysplastic syndromes (MDS), we investigated clonal dynamics using whole-exome and/or targeted sequencing of 699 patients, of whom 122 were analyzed longitudinally. Including the results from previous reports, we assessed a total of 2,250 patients for mutational enrichment patterns. During progression, the number of mutations, their diversity and clone sizes increased, with alterations frequently present in dominant clones with or without their sweeping previous clones. Enriched in secondary acute myeloid leukemia (sAML; in comparison to high-risk MDS), FLT3, PTPN11, WT1, IDH1, NPM1, IDH2 and NRAS mutations (type 1) tended to be newly acquired, and were associated with faster sAML progression and a shorter overall survival time. Significantly enriched in high-risk MDS (in comparison to low-risk MDS), TP53, GATA2, KRAS, RUNX1, STAG2, ASXL1, ZRSR2 and TET2 mutations (type 2) had a weaker impact on sAML progression and overall survival than type-1 mutations. The distinct roles of type-1 and type-2 mutations suggest their potential utility in disease monitoring.

Abstract Genome-wide genetic screens have identified cellular dependencies in many cancers. Using the Broad Institute’s Achilles shRNA screening dataset, we mined for targetable dependencies by cell lineage. Our studies identified a strong dependency on BCL2L1 , which encodes the BCL-X L anti-apoptotic protein, in a subset of kidney cancer cells. Genetic and pharmacological inactivation of BCL-X L , but not the related anti-apoptotic proteins BCL-2, led to fitness defects in renal cancer cells, and also sensitized them to chemotherapeutics. Neither BCL-X L levels (absolute or normalized to BCL-2) nor the status of the VHL gene, which is frequently mutated in kidney cancer, predicted BCL-X L dependence. Transcriptional profiling, however, identified a ‘BCL-X L dependency’ mRNA signature, which included elevated mesenchymal gene expression in BCL-X L dependent cells. Promoting mesenchymal transition increased BCL-X L dependence; whereas, conversion to a more differentiated state overcame BCL-X L dependence in kidney cancer cells. The ‘BCL-X L dependency’ mRNA signature was observed in almost a third of human clear cell Renal Cell Carcinomas (ccRCCs), which were also associated with worse clinical outcomes. Finally, an orally bioavailable BCL-X L inhibitor, A-1331852, showed anti-tumor efficacy in vivo . Altogether, our studies uncovered an unexpected link between cancer cell state and dependence on the anti-apoptotic BCL-X L protein and justify further testing on BCL-X L blockade as a potential way to target a clinically aggressive subset of human kidney cancers. One Sentence Summary Cell state, but not pVHL and/or HIF status, defines the dependency of kidney cancer cells on the BCL-X L anti-apoptotic protein.

Abstract Recent advances in cancer immunotherapy have created a greater appreciation of potential anti-tumoral impacts by the immune system; however, individual patient responses have been variable. While immunotherapy is often given after standard-of-care treatment, the effects of initial interventions on the ability of the immune system to mount a response are not well understood and this may contribute to the variable response. For glioblastoma (GBM), initial disease management includes surgical resection, perioperative high-dose steroid therapy, chemotherapy, and radiation treatment. While new discoveries regarding the impact of chemotherapy and radiation on immune response have been made and translated to clinical trial design, the impact of surgical resection and steroids on the anti-tumor immune response has yet to be determined. Further, it is now accepted that steroid usage needs to be closely evaluated in the context of GBM and immunotherapy trials. To better model the clinical scenario in GBM, we developed a mouse model that integrates tumor resection and steroid treatment to understand how these therapies affect local and systemic immune responses. Using this model, we observed a systemic reduction in lymphocytes associated with surgical resection and identified a correlation between increased tumor volume and decreased circulating lymphocytes, a relationship that was obviated by dexamethasone treatment. Furthermore, we investigated the possibility of there being similar relationships in a cohort of patients with GBM and found that prior to steroid treatment, circulating lymphocytes inversely correlated with tumor volume. Lastly, correlating GBM patient data and outcomes demonstrated that peripherally circulating lymphocyte content varies with progression-free and overall survival, independent of tumor volume, steroid use, or tumor molecular profiles. These results highlight the systemic immunosuppressive effects that initial therapies can have on patients. Such effects should be considered when designing current and future immunotherapy clinical trials and underscore the importance of circulating lymphocytes as a possible correlate of GBM disease progression.

Mechanisms-of-resistance to decitabine and 5-azacytidine, mainstay treatments for myeloid malignancies, require investigation and countermeasures. Both are nucleoside analog pro-drugs processed by pyrimidine metabolism into a nucleotide analog that depletes the key epigenetic regulator DNA methyltranseferase 1 (DNMT1). We report here that DNMT1 protein, although substantially depleted in patients bone marrows at response (~50%), rebounded at relapse, and explaining this, we found pyrimidine metabolism gene expression shifts averse to the processing of each pro-drug. The same metabolic shifts observed clinically were rapidly recapitulated in leukemia cells exposed to the pro-drugs in vitro. Pyrimidine metabolism is a network that senses and preserves nucleotide balances: Decitabine, a deoxycytidine analog, and 5-azacytidine, a cytidine analog, caused acute and distinct nucleotide imbalances, by off-target inhibition of thymidylate synthase and ribonucleotide reductase respectively. Resulting expression changes in key pyrimidine metabolism enzymes peaked 72-96 hours later. Continuous pro-drug exposure stabilized metabolic shifts generated acutely, preventing DNMT1-depletion and permitting exponential leukemia out-growth as soon as day 40. Although dampening to activity of the pro-drug initially applied, adaptive metabolic responses primed for activity of the other. Hence, in xenotransplant models of chemorefractory AML, alternating decitabine with 5-azacytidine, timed to exploit compensating metabolic shifts, and addition of an inhibitor of a catabolic enzyme induced by decitabine/5-azacytidine, extended DNMT1-depletion and time-to-distress by several months versus either pro-drug alone. In sum, resistance to decitabine and 5-azacytidine emerges from adaptive responses of the pyrimidine metabolism network; these responses can be anticipated and thus exploited.

Abstract Growth Factor Independence 1 (GFI1) is a hematopoietic transcription factor that plays a crucial role in the development of myeloid precursor cells. Its variant single nucleotide polymorphism called GFI136N (whereby Serine at position 36 is replaced by Asparagine) has been described to play a role in acute myeloid leukemia (AML) development. The prevalence of this variant is about 5-7% in the healthy Caucasian populations. Patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show disturbed bone marrow function and are at risk to develop AML. Identifying prognostic markers and potential targets is essential for improved MDS therapy. We explored how GFI136N influences onset and progression of MDS and investigated the biological mechanisms behind our findings. To examine the role of GFI136N with regard to progression of MDS to AML, we characterized the status of GFI1 in 201 German-, 350 US- and 86 Dutch MDS patients. Our results revealed that 11-13% of patients were heterozygous for GFI136N compared to 5-7% in the healthy population. Patients carrying GFI136N also showed a 2-3-fold higher risk of AML-development and inferior leukemia-free survival than patients carrying the common variant GFI136S. The onset of MDS and AML tended to be at younger ages for GFI136N carriers and they did not respond to demethylating therapy to the same extent as GFI136S homozygous MDS patients. Whole exome sequencing revealed that patients carrying GFI136N had mutations in epigenetic modifiers such as EZH2 and expressed higher levels of different oncogenes such as HOXA9. To dissect the mechanisms behind these findings and to study the role of GFI136N in AML development, we used GFI136N and GFI136S knock-in mice that expressed either of the two human variants instead of murine Gfi1. We transduced hematopoietic progenitor cells from GFI136S or GFI136N expressing mice with retroviral vectors overexpressing oncofusion proteins AML1-ETO9a or MLL-AF9, which can be recurrently found in AML patient cohorts. GFI136N expressing cells that had been transduced with either AML1-ETO9a or MLL-AF9 generated significantly more cells and colonies than GFI136S controls. In order to confirm our findings in vivo, we used three different AML and MDS mouse models crossed to mice carrying either GFI136N or the common GFI136S. As a first in vivoapproach, we used a mouse strain that expresses the human oncofusion protein CBFB-MYH11 (inv(16)) frequently found in AML patients. Mice carrying GFI136N and expressing CBFB-MYH11 showed a significantly accelerated onset of AML compared to mice carrying GFI136S (p=0.004). We found similar results in a second AML mouse model expressing MLL-AF9. Using the NUP98-HOXD13 MDS mouse model a marginally significant decrease in leukemia-free survival was observed in mice carrying GFI136N. To investigate molecular mechanisms that could cause the observed effects of GFI136N, we used ChipSeq and RNASeq. Our results revealed that GFI136N lineage negative cells show a genome-wide higher degree of H3K4 methylation and H3K9 acetylation than cells carrying GFI136S. GFI1 recruits among others LSD1 and HDAC to demethylate H3K4 and deacetylate H3K9 and thus GFI136N fails to initiate epigenetic changes previously shown for GFI1, leading to higher expression of various oncogenes such as HoxA9 and Kras. A number of MDS and AML patients are treated with HDAC and LSD1 inhibitors, but based on the above data we would predict that this therapy would likely fail in GFI136N patients and that therapy with histone acetylase (HAT) inhibitors or histone methyltransferase inhibitors would be more beneficial for these patients. To test this hypothesis in vitro, we treated the above-described GFI136N and GFI136S expressing AML1-ETO9a or MLL-AF9 leukemic cells with HAT or HDAC inhibitors. HAT inhibitors inhibited growth of preleukemic GFI136N expressing cells more efficiently than HDAC inhibitors. Similarly in vivo, we transplanted irradiated mice with GFI136N or GFI136S expressing MLL-AF9 leukemic cells. We found that HAT inhibitors tended to prolong the survival of mice transplanted with GFI136N leukemic cells more than mice transplanted with GFI136S leukemic cells. In summary, GFI136N is a novel prognostic marker for MDS patients that predisposes to AML likely via epigenetic changes at different oncogenes. We also suggest that HAT inhibitors could be more beneficial to GFI136N carrier patients thus enabling a more individualized therapy. Disclosures Platzbecker: TEVA: Research Funding, Speakers Bureau.

Glioblastoma (GBM) remains uniformly lethal, and, despite a large accumulation of immune cells in the microenvironment, there is limited anti-tumor immune response, even with newly developed immune checkpoint therapies. To overcome these challenges and enhance the efficacy of immunotherapies, a comprehensive understanding of the immune system in GBM and changes during disease progression is required. Here, we integrated multi-parameter flow cytometry and mass cytometry time of flight (CyTOF) analysis of patient blood to determine changes in the immune system among tumor types and over disease progression. Utilizing multi-parameter flow cytometry analysis in a cohort of over 250 patients with brain tumors ranging from benign to malignant primary and metastatic, we found that GBM patients had a significant elevation in myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in blood, but not immunosuppressive T regulatory cells. We validated these findings in GBM patient tissue and found that increased numbers of MDSCs in recurrent GBM portended poor prognosis. CyTOF analysis of peripheral blood from a cohort of newly diagnosed GBM patients revealed that reduction in MDSC frequency over time is accompanied by a concomitant increase in dendritic cells and natural killer cells. This reduced MDSC profile was present in GBM patients with extended survival and was similar to that of low-grade glioma (LGG) patients. Our findings provide a rationale for developing strategies to target MDSCs, which are elevated in GBM patients and predict poor prognosis, either by directly targeting or by shifting the immune profile to induce differentiation toward the immune profile of LGGs.

Background: Emerging diagnostic modalities suggest that miRNA profiles within extracellular vesicles (EVs) isolated from peripheral blood specimens may provide a non-invasive diagnostic alternative for dementia and neurodegenerative disorders. Given that EVs confer a protective environment against miRNA enzymatic degradation, the miRNAs enriched in the EV fraction of blood samples could serve as more stable and clinically relevant biomarkers compared to those obtained from serum. Objective: To compare miRNAs isolated from EVs versus serum in blood taken from Alzheimer’s disease (AD) dementia patients and control cohorts. Methods: We compared 25 AD patients to 34 individuals who exhibited no cognitive impairments (NCI). Subjects were Singapore residents with Chinese heritage. miRNAs purified from serum versus blood-derived EVs were analyzed for associations with AD dementia and medial temporal atrophy detected by magnetic resonance imaging. Results: Compared to serum-miRNAs, we identified almost twice as many EV-miRNAs associated with AD dementia, and they also correlated more significantly with medial temporal atrophy, a neuroimaging marker of AD-brain pathology. We further developed combination panels of serum-miRNAs and EV-miRNAs with improved performance in identifying AD dementia. Dominant in both panels was miRNA-1290. Conclusions: This data indicates that miRNA profiling from EVs offers diagnostic superiority. This underscores the role of EVs as vectors harboring prognostic biomarkers for neurodegenerative disorders and suggests their potential in yielding novel biomarkers for AD diagnosis.