Mantle cell lymphoma (MCL) is an incurable B-cell non-Hodgkin's lymphoma. MCL patients who relapse on targeted therapies have a particularly poor prognosis. Protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5), an enzyme that drives symmetric dimethylation of arginine (SDMA) residues, is overexpressed in MCL and promotes MCL growth and survival. Thus, PRMT5 has emerged as an attractive therapeutic target in MCL. We developed a small molecule PRMT5 inhibitor (PRT-382) that exhibits significant anti-MCL activity in cell lines (50-100 nM) and in vivo preclinical MCL murine models (10 mg/kg, daily, four days on; 3 days off). Despite the anti-tumor activity of PRMT5 inhibition, we have observed some animals develop drug resistance leading to rapid progression of MCL despite continued treatment with PRT-382. While treatment with PRT-382 significantly prolonged the survival of our MCL patient derived xenograft (PDX) model (83D vs. 48D, p-value: 0.0045), one mouse developed a rapid and much greater expansion of MCL cells both in the peripheral blood and in multiple organs when it reached early removal criteria at day 90. Despite the significantly increased tumor burden in this mouse while on PRMT5 inhibitory therapy, SDMA reduction in MCL tumor cells was still achieved in comparison to the vehicle control treated mice. MCL tumor cells from this PRMT5 inhibitor refractory mouse and PRMT5 inhibitor naïve mice were re-engrafted and treated with PRT-382. Compared to mice engrafted with treatment naïve cells, the mice engrafted with PRMT5 inhibitor refractory cells had decreased survival (p-value: 0.004). Thus, in vivo resistance was retained allowing generation of additional samples for mechanistic studies. In addition to in vivo models of resistance, some MCL cell lines (Maver, Mino, UPN1, and Jeko) show primary resistance to PRMT5 inhibition based on high IC50s of PRT-382 (mean: 800; range: 300-2000 nM) compared to the sensitivity to this drug in other MCL cell lines (mean: 80; range: 50-100 nM). Prolonged culture of four PRT-382 sensitive MCL lines (CCMCL, Rec-1, SP53, and Z-138) with drug escalation produced cell lines with acquired PRT-382 resistance with IC50s 3 to 5 times (200-500 nM) that of parental lines. We found this PRMT5 inhibitor resistance persisted after prolonged culture (30d) in the absence of drug. As observed in the MCL PDX PRMT5 inhibitor refractory mice, SDMA reduction was still achieved at the original PRT-382 doses. Utilizing single cell RNA sequencing (scRNA-seq) and bulk RNA-sequencing, these multiple in vivo and in vitro PRMT5 inhibitor resistant samples were evaluated in comparison with their parental/untreated counterparts to identify compensatory pro-survival pathways amplified with PRMT5 inhibitor resistance. ScRNA-seq analysis on MCL PDX samples demonstrated a strong shift in global gene expression depending on treatment duration and condition. Upregulation of Insulin Receptor, PI3K, MAPK, and MTOR signaling were identified using Ingenuity Pathway Analysis (p-value threshold of 0.001 and z-score of 1.1) based on differentially expressed genes with PRMT5 inhibitor treatment in the resistant cell lines and PDX in comparison to their sensitive or parental counterparts. In vitro drug combination analysis has demonstrated synergy inhibiting PRMT5 (PRT-382) in combination with PI3K/MTORC1 and 2 (Omipalisib), MTORC1 (Temsirolimus), and EIF1A (Silvestrol) in MCL cell lines with primary (Mino) and acquired (Rec-1, SP53, and Z-138) resistance to PRMT5 inhibition. We are currently mechanistically validating these pathways in our in vitro models and invivo preclinical MCL models.

Abstract Infections and disease caused by the obligate human pathogen Bordetella pertussis (Bp) are increasing, despite widespread vaccinations. The current acellular pertussis vaccines remain ineffective against nasopharyngeal colonization, carriage, and transmission. In this work, we tested the hypothesis that Bordetella polysaccharide (Bps), a member of the poly-β-1,6- A -acetyl-D-glucosamine (PNAG/PGA) family of polysaccharides promotes respiratory tract colonization of Bp by resisting killing by antimicrobial peptides (AMPs). Genetic deletion of the bpsA-D locus, as well as treatment with the specific glycoside hydrolase Dispersin B, increased susceptibility to AMP-mediated killing. Bps was found to be both cell surface-associated and secreted during laboratory growth and mouse infections. Addition of bacterial supernatants containing Bps and purified Bps increased B. pertussis resistance to AMPs. By utilizing ELISA, immunoblot and flow cytometry assays, we show that Bps functions as a dual surface shield and decoy by inhibiting AMP binding. Co-inoculation of C57BL/6J mice with a Bps-proficient strain enhanced respiratory tract survival of the Bps-deficient strain. In combination, the presented results highlight the critical role of Bps as a central driver of B. pertussis pathogenesis. Heterologous production of Bps in a non-pathogenic E. coli K12 strain increased AMP resistance in vitro, and augmented bacterial survival and pathology in the mouse respiratory tract. Therefore, by conferring virulence traits across bacterial genera, Bps transforms a primarily intestinal and urinary tract bacterium into a respiratory pathogen. These studies can serve as a foundation for other PNAG/PGA polysaccharides and for the development of an effective Bp vaccine that includes Bps. Author summary Pertussis or whooping cough, caused by the obligate human pathogen Bordetella pertussis (Bp), is resurging in many countries. Currently, the mechanism by which B. pertussis subverts and resists host immunity is poorly known. In this manuscript, we examined the role of the B. pertussis polysaccharide Bps in promoting resistance to antimicrobial peptides (AMPs), a critical component of host immune defense. We show that the presence of Bps on the bacterial cell surface enhanced AMP resistance. Bps was secreted both during bacterial growth and during mouse infections. We further found that Bps functioned both as a surface shield and decoy, thereby inhibiting AMP binding. Simultaneous infection of mice with Bps-proficient and Bps- deficient strains resulted in greater survival of the Bps-deficient strain in the mouse respiratory tract. Finally, production of Bps in a non-pathogenic E. coli strain increased AMP resistance in vitro, and increased bacterial survival and heightened pathology in the mouse respiratory tract. Our study provides new insights into how B. pertussis has evolved to survive in the mammalian respiratory tract. Additionally, these studies underscore the potential of a single virulence factor to convert a non-pathogenic bacterium into a respiratory tract pathogen.

Bordetella bronchiseptica ( B. bronchiseptica ) is an etiologic agent of respiratory diseases in animals and humans. Despite widespread use of veterinary B. bronchiseptica vaccines, there is limited information on their composition, relative efficacy, and the immune responses they elicit. Furthermore, human B. bronchiseptica vaccines are not available. We leveraged the dual antigenic and adjuvant functions of BcfA to develop acellular B. bronchiseptica vaccines in the absence of an additional adjuvant. Balb/c mice immunized with BcfA alone or a trivalent vaccine containing BcfA and the Bordetella antigens FHA and Prn were equally protected against challenge with a prototype B. bronchiseptica strain. The trivalent vaccine protected mice significantly better than the canine vaccine Bronchicine® and provided protection against a B. bronchiseptica strain isolated from a dog with kennel cough. Th1/17-polarized immune responses correlate with long-lasting protection against Bordetellae and other respiratory pathogens. Notably, BcfA strongly attenuated the Th2 responses elicited by FHA/Prn, resulting in Th1/17-skewed responses in inherently Th2-skewed Balb/c mice. Thus, BcfA functions as both an antigen and an adjuvant, providing protection as a single component vaccine. BcfA-adjuvanted vaccines may improve the efficacy and durability of vaccines against Bordetellae and other pathogens.

ABSTRACT Vaccines against SARS-CoV-2 that induce mucosal immunity capable of preventing infection and disease remain urgently needed. We show that intramuscular priming of mice with an alum and BcfA-adjuvanted Spike subunit vaccine, followed by a BcfA-adjuvanted mucosal booster, generated Th17 polarized tissue resident CD4+ T cells, and mucosal and serum antibodies. The serum antibodies efficiently neutralized SARS-CoV-2 and its Delta variant, suggesting cross-protection against a recent variant of concern (VOC). Immunization with this heterologous vaccine prevented weight loss following challenge with mouse-adapted SARS-CoV-2 and reduced viral replication in the nose and lungs. Histopathology showed a strong leukocyte and polymorphonuclear (PMN) cell infiltrate without epithelial damage in mice immunized with BcfA-containing vaccines. In contrast, viral load was not reduced in the upper respiratory tract of IL-17 knockout mice immunized with the same formulation, suggesting that the Th17 polarized T cell responses are critical for protection. We show that vaccines adjuvanted with alum and BcfA, delivered through a heterologous prime-pull regimen, protect against SARS-CoV-2 infection without causing enhanced respiratory disease. SIGNIFICANCE There remains a need for SARS CoV-2 booster vaccines that generate mucosal immunity and prevent transmission. We show that systemic priming followed by a mucosal booster with a BcfA-adjuvanted subunit vaccine generates neutralizing antibodies and Th17 polarized systemic and tissue-resident immune responses that provide sterilizing immunity against wildtype SARS CoV-2, and a variant of concern. Importantly, in contrast to alum alone, the addition of BcfA prevents respiratory pathology. These results suggest that a BcfA-adjuvanted mucosal booster may elicit mucosal immunity in individuals previously immunized systemically with approved vaccines. This foundational study in mice sets the stage for testing our vaccine regimen in larger animal models as a booster vaccine.

Maternal infection during pregnancy is a known risk factor for offspring mental health disorders. Animal models of maternal immune activation (MIA) have implicated specific cellular and molecular etiologies of psychiatric illness, but most rely on pathogen mimetics. Here, we developed a mouse model of live H3N2 influenza A virus (IAV) infection during pregnancy that induces a robust inflammatory response but is sublethal to both dams and offspring. We observed lung inflammatory cytokine production and severely diminished weight gain in IAV-infected dams. This was accompanied by immune cell infiltration in the placenta and partial breakdown of placental integrity. However, indications of IL-17A signaling and fetal neuroinflammation, which are hallmarks of mimetic-induced MIA, were not detected. Our results suggest that mild or moderately pathogenic IAV infection during pregnancy does not inflame the developing fetal brain, and highlight the importance of live pathogen infection models for the study of MIA.