ABSTRACT Janus kinases (JAKs) mediate cytokine signaling, cell growth and hematopoietic differentiation. 1 Gain-of-function mutations activating JAK2 signaling are seen in the majority of myeloproliferative neoplasm (MPN) patients, most commonly due to the JAK2 V617F driver allele. 2 While clinically-approved JAK inhibitors improve symptoms and outcomes in MPNs, remissions are rare, and mutant allele burden does not substantively change with chronic JAK inhibitor therapy in most patients. 3, 4 This has been postulated to be due to incomplete dependence on constitutive JAK/STAT signaling, alternative signaling pathways, and/or the presence of cooperating disease alleles; 5 however we hypothesize this is due to the inability of current JAK inhibitors to potently and specifically abrogate mutant JAK2 signaling. We therefore developed a conditionally inducible mouse model allowing for sequential activation, and then inactivation, of Jak2 V617F from its endogenous locus using a Dre- rox /Cre- lox dual orthogonal recombinase system. Deletion of oncogenic Jak2 V617F abrogates the MPN disease phenotype, induces mutant-specific cell loss including in hematopoietic stem/progenitor cells, and extends overall survival to an extent not observed with pharmacologic JAK inhibition. Furthermore, reversal of Jak2 V617F in MPN cells with antecedent loss of Tet2 6, 7 abrogates the MPN phenotype and inhibits mutant stem cell persistence suggesting cooperating epigenetic-modifying alleles do not alter dependence on mutant JAK/STAT signaling. Our results suggest that mutant-specific inhibition of JAK2 V617F represents the best therapeutic approach for JAK2 V617F -mutant MPN and demonstrate the therapeutic relevance of a dual-recombinase system to assess mutant-specific oncogenic dependencies in vivo .

Summary Cancer evolution is a multifaceted process involving the acquisition of somatic mutations and progressive epigenetic dysregulation of cellular fate. Both cell-intrinsic mechanisms and environmental interactions provide selective pressures capable of promoting clonal evolution and expansion, with single-cell and bulk DNA sequencing offering increased resolution into this process 1-4 . Advances in genome editing, single-cell biology and expressed lentiviral barcoding have enabled new insights into how transcriptional/epigenetic states change with clonal evolution 5,6 . Despite the extensive catalog of genomic alterations revealed by resequencing studies 7,8 , there remain limited means to functionally model and perturb this evolutionary process in experimental systems 9 . Here we integrated multi-recombinase (Cre, Flp, and Dre) tools for modeling reversible, sequential mutagenesis from premalignant clonal hematopoiesis to acute myeloid leukemia. We demonstrate that somatic acquisition of Flt3 activating mutations elicits distinct phases of acute and chronic activation resulting in differential cooperativity with Npm1 and Dnmt3a disease alleles. We next developed a generalizable allelic framework allowing for the reversible expression of oncogenic mutations at their endogenous loci. We found that reversal of mutant Flt3 resulted in rapid leukemic regression with distinct alterations in cellular compartments depending upon co-occurring mutations. These studies provide a path to model sequential mutagenesis and deterministically investigate mechanisms of transformation and oncogenic dependency in the context of clonal evolution.