Abstract Different high temperatures adversely affect crop and algal yields with various responses in photosynthetic cells. The list of genes required for thermotolerance remains elusive. Additionally, it is unclear how carbon source availability affects heat responses in plants and algae. We utilized the insertional, indexed, genome-saturating mutant library of the unicellular, eukaryotic green alga Chlamydomonas reinhardtii to perform genome-wide, quantitative, pooled screens under moderate (35°C) or acute (40°C) high temperatures with or without organic carbon sources. We identified heat-sensitive mutants based on quantitative growth rates and identified putative heat tolerance genes (HTGs). By triangulating HTGs with heat-induced transcripts or proteins in wildtype cultures and MapMan functional annotations, we present a high/medium-confidence list of 933 Chlamydomonas genes with putative roles in heat tolerance. Triangulated HTGs include those with known thermotolerance roles and novel genes with little or no functional annotation. About 50% of these high-confidence HTGs in Chlamydomonas have orthologs in green lineage organisms, including crop species. Arabidopsis thaliana mutants deficient in the ortholog of a high-confidence Chlamydomonas HTG were also heat sensitive. This work expands our knowledge of heat responses in photosynthetic cells and provides engineering targets to improve thermotolerance in algae and crops.

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is an excellent model organism to investigate many essential cellular processes in photosynthetic eukaryotes. Two commonly used background strains of Chlamydomonas are CC 1690 and CC-5325. CC-1690, also called 21gr, has been used for the Chlamydomonas genome project and several transcriptome analyses. CC-5325 is the background strain for the Chlamydomonas Library Project (CLiP). Photosynthetic performance in CC-5325 has not been evaluated in comparison with CC-1690. Additionally, CC-5325 is often considered to be cell-wall deficient, although detailed analysis is missing. The circadian rhythms in CC-5325 are also unclear. To fill these knowledge gaps and facilitate the use of the CLiP mutant library for various screens, we performed phenotypic comparisons between CC-1690 and CC-5325. Our results showed that CC-5325 grew faster heterotrophically in dark and equally well in mixotrophic liquid medium as compared to CC-1690. CC-5325 had lower photosynthetic efficiency and was more sensitive to heat than CC-1690. Furthermore, CC-5325 had an intact cell wall with comparable integrity to that in CC-1690, though appears to have reduced thickness. Finally, CC-5325 could perform phototaxis, but could not maintain a sustained circadian rhythm of phototaxis as CC160 did. Our results will be useful for researchers in the Chlamydomonas community to choose suitable background strains for mutant analysis and employ the CLiP mutant library for genome-wide mutant screens under appropriate conditions, especially in the areas of photosynthesis, thermotolerance, cell wall, and circadian rhythms.

Abstract An explosion of sequenced genomes and predicted proteomes enabled by low cost deep sequencing has revolutionized biology. Unfortunately, protein functional annotation is more complex, and has not kept pace with the sequencing revolution. We identified unannotated proteins in three model organisms representing distinct parts of the green lineage (Viridiplantae); Arabidopsis thaliana (dicot), Setaria viridis (monocot), and Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyte alga). Using similarity searching we found the subset of unannotated proteins that were conserved between these species and defined them as Deep Green proteins. Informatic, genomic, and structural predictions were leveraged to begin inferring functional information about Deep Green genes and proteins. The Deep Green set was enriched for proteins with predicted chloroplast targeting signals that are predictive of photosynthetic or plastid functions. Strikingly, structural predictions using AlphaFold and comparisons to known structures show that a significant proportion of Deep Green proteins may possess novel protein tertiary structures. The Deep Green genes and proteins provide a starting resource of high value targets for further investigation of potentially new protein structures and functions that are conserved in the green lineage.

Abstract High temperatures impair plant and algal growth and reduce food and biofuel production, but the underlying mechanisms remain elusive. The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is a superior model to study heat responses in photosynthetic cells due to its fast growth rate, many similarities in cellular processes to land plants, simple and sequenced genome, and ample genetic and genomics resources. Chlamydomonas grows in light by photosynthesis and/or with the externally supplied organic carbon source, acetate. Most of the published research about Chlamydomonas heat responses used acetate-containing medium. Understanding how organic carbon sources affect heat responses is important for the algal industry but understudied. We cultivated Chlamydomonas wild-type cultures under highly controlled conditions in photobioreactors at control of 25°C, moderate high temperature of 35°C, or acute high temperature of 40°C with and without constant acetate supply for 1- or 4-days. Our results showed that 35°C increased algal growth with constant acetate supply but reduced algal growth without sufficient acetate. The overlooked and dynamic effects of 35°C could be explained by induced carbon metabolism, including acetate uptake and assimilation, glyoxylate cycle, gluconeogenesis pathways, and glycolysis. Acute high temperature at 40°C for more than 2 days was lethal to algal cultures with and without constant acetate supply. Our research provides insights to understand algal heat responses and help improve thermotolerance in photosynthetic cells. Highlight We revealed the overlooked, dynamic effects of moderate high temperature in algae depending on carbon availability and demonstrated the importance of carbon metabolism in thermotolerance of photosynthetic cells.