Summary During mammalian embryogenesis, DNMT3B activity is critical for the genome-wide establishment of DNA methylation. Using naïve ESC differentiation as a model, we elucidated the mechanism by which lncRNA, Dnmt3bas, controls the inducible expression and alternative splicing of Dnmt3b . Our data showed that Dnmt3bas knockdown increased transcriptional induction and decreased H3K27me3 at Dnmt3b cis-regulatory elements post-differentiation. Notably, transcriptional induction of Dnmt3b was accompanied by exon inclusion, switching the major isoform from catalytically inactive Dnmt3b6 to the active Dnmt3b1 . While Dnmt3bas overexpression attenuated Dnmt3b induction, it increased the Dnmt3b1:Dnmt3b6 ratio. This observation was explained by a specific interaction of Dnmt3bas with hnRNPL, which promotes exon inclusion. These data suggest that Dnmt3bas coordinates alternative splicing and transcriptional induction of Dnmt3b by facilitating the interaction of hnRNPL and RNA Pol II at the Dnmt3b promoter. This two-pronged mechanism would tightly control DNMT3B activity, ensuring the fidelity and specificity of de novo DNA methylation during development.

An aberrant increase in pluripotency gene (PpG) expression due to enhancer reactivation could induce stemness and enhance tumorigenicity of cancer stem cells. Silencing of PpG enhancers (PpGe) during embryonic stem cell differentiation involves Lsd1–mediated H3K4me1 demethylation and DNA methylation. Here, we observed retention of H3K4me1 and DNA hypomethylation at PpGe associated with a partial repression of PpGs in F9 embryonal carcinoma cells (ECCs) post-differentiation. H3K4me1 demethylation in F9 ECCs could not be rescued by Lsd1 overexpression. Given our observation that H3K4me1 demethylation is accompanied by strong Oct4 repression in P19 ECCs, we tested if Oct4 interaction with Lsd1 affects its catalytic activity. Our data show a dose-dependent inhibition of Lsd1 activity by Oct4 and retention of H3K4me1 at PpGe in Oct4 overexpressing P19 ECCs. These data suggest that Lsd1-Oct4 interaction in cancer stem cells could establish a primed enhancer state that is susceptible to reactivation leading to aberrant PpG expression.

Abstract The role of ER Ca 2+ release via ryanodine receptors (RyR) in pancreatic β-cell function is not well defined. Deletion of RyR2 from the rat insulinoma INS-1 (RyR2 KO ) enhanced the Ca 2+ integral (AUC) stimulated by 7.5 mM glucose, and rendered it sensitive to block by the IP 3 receptor inhibitor xestospongin C, coincident with reduced levels of the protein IP 3 R eceptor B inding protein released with Inositol 1,4,5 T risphosphate (IRBIT; aka AHCYL1). Deletion of IRBIT from INS-1 cells (IRBIT KO ) increased the Ca 2+ AUC in response to 7.5 mM glucose and induced xestospongin sensitivity. Insulin content and basal (2.5 mM glucose) and 7.5 mM glucose-stimulated insulin secretion were reduced in RyR2 KO cells and more modestly reduced in IRBIT KO cells compared to controls. INS2 mRNA levels were reduced in both RyR2 KO and IRBIT KO cells, but INS1 mRNA levels were specifically decreased in RyR2 KO cells. Nuclear localization of S-adenosylhomocysteinase (AHCY) was increased in RyR2 KO and IRBIT KO cells. DNA methylation of the INS1 and INS2 gene promotor regions was very low, and not different among RyR2 KO , IRBIT KO , and controls. In contrast, exon 2 of the INS1 and INS2 genes was more extensively methylated in RyR2 KO and IRBIT KO cells than in controls. Proteomics analysis using LC-MS/MS revealed that deletion of RyR2 or IRBIT resulted in differential regulation of 314 and 137 proteins, respectively, with 41 in common. These results suggest that RyR2 regulates IRBIT levels and activity in INS-1 cells, and together maintain insulin content and secretion, and regulate the proteome, perhaps via DNA methylation. One sentence Summary Deletion of RyR2 from INS-1 cells had the unanticipated effect of reducing IRBIT proteins levels, and both RyR2 and IRBIT contribute to maintenance of glucose- stimulated insulin secretion.