As the sample size in cancer genome studies increases, the list of genes identified as significantly mutated is likely to include more false positives; here, this problem is identified as stemming largely from mutation heterogeneity, and a new analytical methodology designed to overcome this problem is described. Cancer genomic approaches have identified scores of genes responsible for the initiation and progression of cancer. But as the sample sizes increase, the list of putatively significant genes identified by current analytical methods continues to grow and is likely to include many false positives. This study shows that this situation stems largely from mutational heterogeneity and presents a novel methodology, MutSigCV, that overcomes the problem by incorporating mutational heterogeneity into the analysis. Application of MutSigCV to more than 3,000 tumour samples from 27 different tumour types shows that mutation frequencies vary more than 1,000-fold between extreme samples both between and within tumour types. And when applied to a data set on lung cancer, MutSigCV reduced the list of significantly mutated genes from 450 to a more manageable 11, most of them previously reported to be mutated in squamous cell lung cancer. Major international projects are underway that are aimed at creating a comprehensive catalogue of all the genes responsible for the initiation and progression of cancer1,2,3,4,5,6,7,8,9. These studies involve the sequencing of matched tumour–normal samples followed by mathematical analysis to identify those genes in which mutations occur more frequently than expected by random chance. Here we describe a fundamental problem with cancer genome studies: as the sample size increases, the list of putatively significant genes produced by current analytical methods burgeons into the hundreds. The list includes many implausible genes (such as those encoding olfactory receptors and the muscle protein titin), suggesting extensive false-positive findings that overshadow true driver events. We show that this problem stems largely from mutational heterogeneity and provide a novel analytical methodology, MutSigCV, for resolving the problem. We apply MutSigCV to exome sequences from 3,083 tumour–normal pairs and discover extraordinary variation in mutation frequency and spectrum within cancer types, which sheds light on mutational processes and disease aetiology, and in mutation frequency across the genome, which is strongly correlated with DNA replication timing and also with transcriptional activity. By incorporating mutational heterogeneity into the analyses, MutSigCV is able to eliminate most of the apparent artefactual findings and enable the identification of genes truly associated with cancer.

Urothelial carcinoma of the bladder is a common malignancy that causes approximately 150,000 deaths per year worldwide. So far, no molecularly targeted agents have been approved for treatment of the disease. As part of The Cancer Genome Atlas project, we report here an integrated analysis of 131 urothelial carcinomas to provide a comprehensive landscape of molecular alterations. There were statistically significant recurrent mutations in 32 genes, including multiple genes involved in cell-cycle regulation, chromatin regulation, and kinase signalling pathways, as well as 9 genes not previously reported as significantly mutated in any cancer. RNA sequencing revealed four expression subtypes, two of which (papillary-like and basal/squamous-like) were also evident in microRNA sequencing and protein data. Whole-genome and RNA sequencing identified recurrent in-frame activating FGFR3–TACC3 fusions and expression or integration of several viruses (including HPV16) that are associated with gene inactivation. Our analyses identified potential therapeutic targets in 69% of the tumours, including 42% with targets in the phosphatidylinositol-3-OH kinase/AKT/mTOR pathway and 45% with targets (including ERBB2) in the RTK/MAPK pathway. Chromatin regulatory genes were more frequently mutated in urothelial carcinoma than in any other common cancer studied so far, indicating the future possibility of targeted therapy for chromatin abnormalities. This paper reports integrative molecular analyses of urothelial bladder carcinoma at the DNA, RNA, and protein levels performed as part of The Cancer Genome Atlas project; recurrent mutations were found in 32 genes, including those involved in cell-cycle regulation, chromatin regulation and kinase signalling pathways; chromatin regulatory genes were more frequently mutated in urothelial carcinoma than in any other common cancer studied so far. This study of 131 high-grade muscle-invasive urothelial bladder carcinomas, part of The Cancer Genome Atlas (TCGA) project, reports recurrent mutations in 32 genes, including those involved in cell-cycle regulation, chromatin regulation and kinase signalling pathways. Chromatin regulatory genes were more frequently mutated in urothelial carcinoma than in any common cancer studied to date. Recurrent in-frame activating FGFR3–TACC3 fusions and expression or integration of viruses associated with gene inactivation are also identified. Importantly, potential therapeutic targets are identified in 69% of the tumours.

Lung adenocarcinoma, the most common subtype of non-small cell lung cancer, is responsible for more than 500,000 deaths per year worldwide. Here, we report exome and genome sequences of 183 lung adenocarcinoma tumor/normal DNA pairs. These analyses revealed a mean exonic somatic mutation rate of 12.0 events/megabase and identified the majority of genes previously reported as significantly mutated in lung adenocarcinoma. In addition, we identified statistically recurrent somatic mutations in the splicing factor gene U2AF1 and truncating mutations affecting RBM10 and ARID1A. Analysis of nucleotide context-specific mutation signatures grouped the sample set into distinct clusters that correlated with smoking history and alterations of reported lung adenocarcinoma genes. Whole-genome sequence analysis revealed frequent structural rearrangements, including in-frame exonic alterations within EGFR and SIK2 kinases. The candidate genes identified in this study are attractive targets for biological characterization and therapeutic targeting of lung adenocarcinoma.

Abstract The AACR Project GENIE is an international data-sharing consortium focused on generating an evidence base for precision cancer medicine by integrating clinical-grade cancer genomic data with clinical outcome data for tens of thousands of cancer patients treated at multiple institutions worldwide. In conjunction with the first public data release from approximately 19,000 samples, we describe the goals, structure, and data standards of the consortium and report conclusions from high-level analysis of the initial phase of genomic data. We also provide examples of the clinical utility of GENIE data, such as an estimate of clinical actionability across multiple cancer types (>30%) and prediction of accrual rates to the NCI-MATCH trial that accurately reflect recently reported actual match rates. The GENIE database is expected to grow to >100,000 samples within 5 years and should serve as a powerful tool for precision cancer medicine. Significance: The AACR Project GENIE aims to catalyze sharing of integrated genomic and clinical datasets across multiple institutions worldwide, and thereby enable precision cancer medicine research, including the identification of novel therapeutic targets, design of biomarker-driven clinical trials, and identification of genomic determinants of response to therapy. Cancer Discov; 7(8); 818–31. ©2017 AACR. See related commentary by Litchfield et al., p. 796. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 783

Multiple myeloma is an incurable malignancy of plasma cells, and its pathogenesis is poorly understood. Here we report the massively parallel sequencing of 38 tumour genomes and their comparison to matched normal DNAs. Several new and unexpected oncogenic mechanisms were suggested by the pattern of somatic mutation across the data set. These include the mutation of genes involved in protein translation (seen in nearly half of the patients), genes involved in histone methylation, and genes involved in blood coagulation. In addition, a broader than anticipated role of NF-κB signalling was indicated by mutations in 11 members of the NF-κB pathway. Of potential immediate clinical relevance, activating mutations of the kinase BRAF were observed in 4% of patients, suggesting the evaluation of BRAF inhibitors in multiple myeloma clinical trials. These results indicate that cancer genome sequencing of large collections of samples will yield new insights into cancer not anticipated by existing knowledge. Multiple myeloma, a malignancy of plasma cells, remains incurable and is poorly understood. Chapman et al. have used next-generation sequencing to compare 38 multiple myeloma genomes with those of normal cells from the same patients. The disease involves mutations of genes with roles in protein translation, histone methylation and blood coagulation. In terms of clinically relevant findings, unexpected activating mutations were found in the kinase BRAF, inhibitors of which have recently shown dramatic clinical activity. This suggests that BRAF inhibitors should be evaluated in patients with BRAF-mutated multiple myeloma. Multiple myeloma, a malignancy of plasma cells, remains incurable and is poorly understood. Using next-generation sequencing of several multiple myeloma genomes reveals that this disease involves mutations of genes involved in protein translation, histone methylation and blood coagulation. The study suggests that BRAF inhibitors should be evaluated in multiple myeloma clinical trials.

Prostate cancer is the second most common cause of male cancer deaths in the United States. However, the full range of prostate cancer genomic alterations is incompletely characterized. Here we present the complete sequence of seven primary human prostate cancers and their paired normal counterparts. Several tumours contained complex chains of balanced (that is, 'copy-neutral') rearrangements that occurred within or adjacent to known cancer genes. Rearrangement breakpoints were enriched near open chromatin, androgen receptor and ERG DNA binding sites in the setting of the ETS gene fusion TMPRSS2-ERG, but inversely correlated with these regions in tumours lacking ETS fusions. This observation suggests a link between chromatin or transcriptional regulation and the genesis of genomic aberrations. Three tumours contained rearrangements that disrupted CADM2, and four harboured events disrupting either PTEN (unbalanced events), a prostate tumour suppressor, or MAGI2 (balanced events), a PTEN interacting protein not previously implicated in prostate tumorigenesis. Thus, genomic rearrangements may arise from transcriptional or chromatin aberrancies and engage prostate tumorigenic mechanisms.

DNA-demethylating agents have shown clinical anti-tumor efficacy via an unknown mechanism of action. Using a combination of experimental and bioinformatics analyses in colorectal cancer cells, we demonstrate that low-dose 5-AZA-CdR targets colorectal cancer-initiating cells (CICs) by inducing viral mimicry. This is associated with induction of dsRNAs derived at least in part from endogenous retroviral elements, activation of the MDA5/MAVS RNA recognition pathway, and downstream activation of IRF7. Indeed, disruption of virus recognition pathways, by individually knocking down MDA5, MAVS, or IRF7, inhibits the ability of 5-AZA-CdR to target colorectal CICs and significantly decreases 5-AZA-CdR long-term growth effects. Moreover, transfection of dsRNA into CICs can mimic the effects of 5-AZA-CdR. Together, our results represent a major shift in understanding the anti-tumor mechanisms of DNA-demethylating agents and highlight the MDA5/MAVS/IRF7 pathway as a potentially druggable target against CICs.

Abstract The success in lung cancer therapy with programmed death (PD)-1 blockade suggests that immune escape mechanisms contribute to lung tumor pathogenesis. We identified a correlation between EGF receptor (EGFR) pathway activation and a signature of immunosuppression manifested by upregulation of PD-1, PD-L1, CTL antigen-4 (CTLA-4), and multiple tumor-promoting inflammatory cytokines. We observed decreased CTLs and increased markers of T-cell exhaustion in mouse models of EGFR-driven lung cancer. PD-1 antibody blockade improved the survival of mice with EGFR-driven adenocarcinomas by enhancing effector T-cell function and lowering the levels of tumor-promoting cytokines. Expression of mutant EGFR in bronchial epithelial cells induced PD-L1, and PD-L1 expression was reduced by EGFR inhibitors in non–small cell lung cancer cell lines with activated EGFR. These data suggest that oncogenic EGFR signaling remodels the tumor microenvironment to trigger immune escape and mechanistically link treatment response to PD-1 inhibition. Significance: We show that autochthonous EGFR-driven lung tumors inhibit antitumor immunity by activating the PD-1/PD-L1 pathway to suppress T-cell function and increase levels of proinflammatory cytokines. These findings indicate that EGFR functions as an oncogene through non–cell-autonomous mechanisms and raise the possibility that other oncogenes may drive immune escape. Cancer Discov; 3(12); 1355–63. ©2013 AACR. See related commentary by Rech and Vonderheide, p. 1330 This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 1317

John Maris, Matthew Meyerson, Marco Marra and colleagues report results of a large-scale sequencing study of neuroblastoma. They observe a low median exonic mutation frequency and strikingly few recurrently mutated genes in these tumors, highlighting challenges for developing targeted therapeutic strategies based on frequently mutated oncogenic drivers. Neuroblastoma is a malignancy of the developing sympathetic nervous system that often presents with widespread metastatic disease, resulting in survival rates of less than 50%. To determine the spectrum of somatic mutation in high-risk neuroblastoma, we studied 240 affected individuals (cases) using a combination of whole-exome, genome and transcriptome sequencing as part of the Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments (TARGET) initiative. Here we report a low median exonic mutation frequency of 0.60 per Mb (0.48 nonsilent) and notably few recurrently mutated genes in these tumors. Genes with significant somatic mutation frequencies included ALK (9.2% of cases), PTPN11 (2.9%), ATRX (2.5%, and an additional 7.1% had focal deletions), MYCN (1.7%, causing a recurrent p.Pro44Leu alteration) and NRAS (0.83%). Rare, potentially pathogenic germline variants were significantly enriched in ALK, CHEK2, PINK1 and BARD1. The relative paucity of recurrent somatic mutations in neuroblastoma challenges current therapeutic strategies that rely on frequently altered oncogenic drivers.

Next-generation sequencing approaches have been used to investigate the genomes and transcriptomes of an oestrogen-receptor-α-positive metastatic lobular breast cancer from a patient — rather than from a cell line or xenograft — over a 9-year period between the diagnosis of the primary tumour and the appearance of metastasis. Comparison of the somatic non-synonymous coding mutations in the metastasis and the primary tumour of the same patient and the combined analysis of genome and transcriptome data provided insights into the mutational evolution that can occur with disease progression. The cover shows sequence elements of the HAUS3 locus, one of the genes found to be mutated in the tissue (shown in the background) from the primary lobular cancer used for this work. Advances in next generation sequencing have made it possible to precisely characterize the coding mutations that occur during the development and progression of individual cancers. Here, this technique is used to sequence the genomes and transcriptomes of an oestrogen-receptor-α-positive metastatic lobular breast cancer; significant evolution is found to occur with disease progression. Recent advances in next generation sequencing1,2,3,4 have made it possible to precisely characterize all somatic coding mutations that occur during the development and progression of individual cancers. Here we used these approaches to sequence the genomes (>43-fold coverage) and transcriptomes of an oestrogen-receptor-α-positive metastatic lobular breast cancer at depth. We found 32 somatic non-synonymous coding mutations present in the metastasis, and measured the frequency of these somatic mutations in DNA from the primary tumour of the same patient, which arose 9 years earlier. Five of the 32 mutations (in ABCB11, HAUS3, SLC24A4, SNX4 and PALB2) were prevalent in the DNA of the primary tumour removed at diagnosis 9 years earlier, six (in KIF1C, USP28, MYH8, MORC1, KIAA1468 and RNASEH2A) were present at lower frequencies (1–13%), 19 were not detected in the primary tumour, and two were undetermined. The combined analysis of genome and transcriptome data revealed two new RNA-editing events that recode the amino acid sequence of SRP9 and COG3. Taken together, our data show that single nucleotide mutational heterogeneity can be a property of low or intermediate grade primary breast cancers and that significant evolution can occur with disease progression.