Abstract Rationale The most significantly associated atrial fibrillation (AF) risk loci in humans map to a noncoding gene desert upstream of the evolutionarily conserved left-right (LR) transcription factor Pitx2 , a master regulator of LR asymmetric organ development. Pitx2 dosage is fundamentally linked to the development of sinus node dysfunction (SND) and AF, the most common cardiac arrhythmia affecting adults, but the mechanistic basis for this remains obscure. We identified a conserved long noncoding RNA (lncRNA), Playrr , which is exclusively transcribed on the embryo’s right side, opposite to Pitx2 on the left, that participates in mutually antagonistic transcriptional regulation with Pitx2 . Objective The objective of this study was to investigate a role of Playrr in regulating Pitx2 transcription and protecting against the development of cardiac rhythm disturbances. Methods and Results Playrr expression in the developing heart was analyzed with RNA in situ hybridization. Playrr was expressed asymmetrically (on the right) to Pitx2 (on the left) in developing mouse embryos, including in mouse embryonic sinoatrial node cells. We utilized CRISPR/Cas9 genome editing in mice to target Playrr , generating mice lacking Playrr RNA transcript ( Playrr Ex1sj allele). Using qRT-PCR we detected upregulation of the cardiac isoform, Pitx2c , during visceral organ morphogenesis in Playrr Ex1sj mutant embryos. Surface ECG (AliveCor®) and 24-hour telemetry ECG detected bradycardia and irregular interbeat (R-R) intervals suggestive of SND in Playrr Ex1sj mutant adults. Programmed stimulation of Playrr Ex1sj mutant adults resulted in pacing-induced AF. Within the right atrium of Playrr Ex1sj mutant hearts, Masson’s trichrome stain revealed increased collagen deposition indicative of fibrosis, and immunofluorescence demonstrated mis-localization of Connexin 43 in atrial cardiomyocytes. These findings suggested an altered atrial substrate in Playrr Ex1sj adult mice. Finally, transcriptomic analysis by chromatin run-on and sequencing (ChRO-seq) in atria of Playrr Ex1sj mutant mice compared to wild type controls revealed differential expression of genes involved in cell-cell adhesion and motility, fibrosis, and dysregulation of the key cardiac genes Tbx5 and Hcn1 . Conclusions Adult mice lacking functional Playrr lncRNA transcript have baseline bradyarrhythmia and increased susceptibility to AF. These cardiac phenotypes are similar to those observed in Pitx2 heterozygous mice. Interactions between Pitx2 and Playrr may provide a genetic mechanism for modulating Pitx2 dosage and susceptibility to SND and AF.

Sialic acids (Sia) are the primary receptors for influenza viruses, and are widely displayed on cell surfaces and in secreted mucus. Sia may be present in variant forms that include O -acetyl modifications at C4, C7, C8, and C9 positions, and N-acetyl or N-glycolyl at C5. They can also vary in their linkages, including a2-3 or a2-6-linkages. Here, we analyzed the distribution of modified Sia in cells and tissues of wild-type mice, or in mice lacking cytidine 5'-monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH) enzyme that synthesizes N-glycolyl modifications (Neu5Gc). We also examined the variation of Sia forms on erythrocytes and saliva from different animals. To determine the effect of Sia modifications on influenza A virus (IAV) infection, we tested for effects on hemagglutinin (HA) binding and neuraminidase (NA) cleavage. We confirmed that 9- O -acetyl, 7,9- O -acetyl, 4- O -acetyl, and Neu5Gc modifications are widely but variably expressed in mouse tissues, with the highest levels detected in the respiratory and gastrointestinal tracts. Secreted mucins in saliva and surface proteins of erythrocytes showed a great degree of variability in display of modified Sia between different species. IAV HA from different virus strains showed consistently reduced binding to both Neu5Gc and O-acetyl modified Sia; however, while IAV NA were inhibited by Neu5Gc and O -acetyl modifications, there was significant variability between NA types. The modifications of Sia in mucus may therefore have potent effects on the functions of IAV, and may affect both pathogens and the normal flora of different mucosal sites.

The amylase gene (AMY), which codes for a starch-digesting enzyme in animals, underwent several gene copy number gains in humans, dogs, and mice, presumably along with increased starch consumption during the evolution of these species. Here we present evidence for additional AMY copy number expansions in several mammalian species, most of which also consume starch-rich diets. We also show that these independent AMY copy number gains are often accompanied by a gain in enzymatic activity of amylase in saliva. We used multi-species coalescent modeling to provide further evidence that these recurrent AMY gene copy number expansions were adaptive. Our findings underscore the overall importance of gene copy number amplification as a flexible and fast adaptive mechanism in evolution that can independently occur in different branches of the phylogeny.