The Gram-negative opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa has distinct genetic programs that favor either acute and chronic virulence gene expression. Acute virulence is associated with twitching and swimming motility, expression of a type III secretion system (T3SS), and the absence of alginate, Psl, or Pel polysaccharide production. Traits associated with chronic infection include growth as a biofilm, reduced motility, and expression of a type VI secretion system (T6SS). The Rsm post-transcriptional regulatory system plays important roles in the inverse control of phenotypes associated with acute and chronic virulence. RsmA and RsmF are RNA-binding proteins that interact with target mRNAs to control gene expression at the post-transcriptional level. Previous work found that RsmA activity is controlled by at least three small, non-coding regulatory RNAs (RsmW, RsmY, and RsmZ). In this study, we took an in-silico approach to identify additional sRNAs that might function in the sequestration of RsmA and/or RsmF and identified RsmV, a 192 nt transcript with four predicted RsmA/RsmF consensus binding sites. RsmV is capable of sequestering RsmA and RsmF in vivo to activate translation of tssA1, a component of the T6SS, and to inhibit T3SS gene expression. Each of the predicted RsmA/RsmF consensus binding sites contribute to RsmV activity. Electrophoretic mobility shifts assays show that RsmF binds RsmV with >10-fold higher affinity than RsmY and RsmZ. Gene expression studies revealed that the temporal expression pattern of RsmV differs from RsmW, RsmY, and RsmZ. These findings suggest that each sRNA may play distinct roles in controlling RsmA and RsmF activity.

Background Pseudomonas aeruginosa (PA) is a ubiquitous, Gram-negative, bacteria that can attribute its survivability to numerous sensing and signaling pathways; conferring fitness due to speed of response. Post-transcriptional regulation is an energy efficient approach to quickly shift gene expression in response to the environment. The conserved post-transcriptional regulator RsmA is involved in regulating translation of genes involved in pathways that contribute to virulence, metabolism, and antibiotic resistance. Prior high-throughput approaches to map the full regulatory landscape of RsmA have estimated a target pool of approximately 500 genes; however, these approaches have been limited to a narrow range of growth phase, strain, and media conditions. Computational modeling presents a condition-independent approach to generating predictions for binding between the RsmA protein and highest affinity mRNAs. In this study, we draft a two-state thermodynamic model to predict the likelihood of RsmA binding to the 5′ UTR sequence of genes present in the PA genome. Results Our modeling approach predicts 1043 direct RsmA-mRNA binding interactions, including 457 novel mRNA targets. We then perform GO term enrichment tests on our predictions that reveal significant enrichment for DNA binding transcriptional regulators. In addition, quorum sensing, biofilm formation, and two-component signaling pathways were represented in KEGG enrichment analysis. We confirm binding predictions using in vitro binding assays, and regulatory effects using in vivo translational reporters. These reveal RsmA binding and regulation of a broader number of genes not previously reported. An important new observation of this work is the direct regulation of several novel mRNA targets encoding for factors involved in Quorum Sensing and the Type IV Secretion system, such as rsaL and mvaT . Conclusions Our study demonstrates the utility of thermodynamic modeling for predicting interactions independent of complex and environmentally-sensitive systems, specifically for profiling the post-transcriptional regulator RsmA. Our experimental validation of RsmA binding to novel targets both supports our model and expands upon the pool of characterized target genes in PA. Overall, our findings demonstrate that a modeling approach can differentiate direct from indirect binding interactions and predict specific sites of binding for this global regulatory protein, thus broadening our understanding of the role of RsmA regulation in this relevant pathogen.