Summary

 DNA methylation in mammals is highly dynamic during germ cell and preimplantation development but is relatively static during the development of somatic tissues. 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), created by oxidation of 5-methylcytosine (5mC) by Tet proteins and most abundant in the brain, is thought to be an intermediary toward 5mC demethylation. We investigated patterns of 5mC and 5hmC during neurogenesis in the embryonic mouse brain. 5hmC levels increase during neuronal differentiation. In neuronal cells, 5hmC is not enriched at enhancers but associates preferentially with gene bodies of activated neuronal function-related genes. Within these genes, gain of 5hmC is often accompanied by loss of H3K27me3. Enrichment of 5hmC is not associated with substantial DNA demethylation, suggesting that 5hmC is a stable epigenetic mark. Functional perturbation of the H3K27 methyltransferase Ezh2 or of Tet2 and Tet3 leads to defects in neuronal differentiation, suggesting that formation of 5hmC and loss of H3K27me3 cooperate to promote brain development.

Abstract The base 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) was recently identified as an oxidation product of 5-methylcytosine in mammalian DNA. Here, using sensitive and quantitative methods to assess levels of 5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine (5hmdC) and 5-methyl-2′-deoxycytidine (5mdC) in genomic DNA, we investigated whether levels of 5hmC can distinguish normal tissue from tumor tissue. In squamous cell lung cancers, levels of 5hmdC were depleted substantially with up to 5-fold reduction compared with normal lung tissue. In brain tumors, 5hmdC showed an even more drastic reduction with levels up to more than 30-fold lower than in normal brain, but 5hmdC levels were independent of mutations in isocitrate dehydrogenase-1. Furthermore, immunohistochemical analysis indicated that 5hmC is remarkably depleted in many types of human cancer. Importantly, an inverse relationship between 5hmC levels and cell proliferation was observed with lack of 5hmC in proliferating cells. The data therefore suggest that 5hmdC is strongly depleted in human malignant tumors, a finding that adds another layer of complexity to the aberrant epigenome found in cancer tissue. In addition, a lack of 5hmC may become a useful biomarker for cancer diagnosis. Cancer Res; 71(24); 7360–5. ©2011 AACR.

Diversity-generating retroelements (DGRs) create unparalleled levels of protein sequence variation through mutagenic retrohoming. Sequence information is transferred from an invariant template region (TR), through an RNA intermediate, to a protein-coding variable region. Selective infidelity at adenines during transfer is a hallmark of DGRs from disparate bacteria, archaea, and microbial viruses. We recapitulated selective infidelity in vitro for the prototypical Bordetella bacteriophage DGR. A complex of the DGR reverse transcriptase bRT and pentameric accessory variability determinant (Avd) protein along with DGR RNA were necessary and sufficient for synthesis of template-primed, covalently linked RNA-cDNA molecules, as observed in vivo. We identified RNA-cDNA molecules to be branched and most plausibly linked through 2'-5' phosphodiester bonds. Adenine-mutagenesis was intrinsic to the bRT-Avd complex, which displayed unprecedented promiscuity while reverse transcribing adenines of either DGR or non-DGR RNA templates. In contrast, bRT-Avd processivity was strictly dependent on the template, occurring only for the DGR RNA. This restriction was mainly due to a noncoding segment downstream of TR, which specifically bound Avd and created a privileged site for processive polymerization. Restriction to DGR RNA may protect the host genome from damage. These results define the early steps in a novel pathway for massive sequence diversification.

Abstract Micro/nanoscale 3D bioelectrodes gain increasing interest for electrophysiological recording of electroactive cells. Although 3D printing has shown promise to flexibly fabricate 3D bioelectronics compared with conventional microfabrication, relatively‐low resolution limits the printed bioelectrode for high‐quality signal monitoring. Here, a novel multi‐material electrohydrodynamic printing (EHDP) strategy is proposed to fabricate bioelectronics with sub‐microscale 3D gold pillars for in vitro electrophysiological recordings. EHDP is employed to fabricate conductive circuits for signal transmission, which are passivated by polyimide via extrusion‐based printing. Laser‐assisted EHDP is developed to produce 3D gold pillars featuring a diameter of 0.64 ± 0.04 µm. The 3D gold pillars demonstrate stable conductivity under the cell‐culture environment. Living cells can conformally grow onto these sub‐microscale 3D pillars with a height below 5 µm, which facilitates the highly‐sensitive recording of extracellular signals with amplitudes <15 µV. The 3D pillars can apply electroporation currents to reversibly open the cellular membrane for intracellular recording, facilitating the measurement of subtle cellular electrophysiological activities. As a proof‐of‐concept demonstration, fully‐printed chips with multiple culturing chambers and sensing bioelectronics are fabricated for zone‐specific electrophysiological recording in drug testing. The proposed multi‐material EHDP strategy enables rapid prototyping of organ‐on‐a‐chip systems with 3D bioelectronics for high‐quality electrophysiological recordings.