When DNA damage introduces double-strand breaks, the ends formed must undergo processing to prepare them for repair. In related studies by the Sung and Kowalczykowski laboratories, this processing reaction has been replicated in vitro using yeast proteins. Processing minimally requires the activities of a helicase, a nuclease and a single-strand binding protein, although the reaction is enhanced by further addition of three factors that help target the core complex and enhance the unwinding activity. When double-strand breaks occur in DNA, the broken ends must undergo processing to prepare them for repair. Here, and in an accompanying study, this processing reaction has now been replicated in vitro using yeast proteins. Processing minimally requires the activities of a helicase, a nuclease and a single-strand-binding protein, although the reaction is enhanced by the addition of three factors that help to target the core complex and stimulate the unwinding activity. If not properly processed and repaired, DNA double-strand breaks (DSBs) can give rise to deleterious chromosome rearrangements, which could ultimately lead to the tumour phenotype1,2. DSB ends are resected in a 5′ to 3′ fashion in cells, to yield single-stranded DNA (ssDNA) for the recruitment of factors critical for DNA damage checkpoint activation and repair by homologous recombination2. The resection process involves redundant pathways consisting of nucleases, DNA helicases and associated proteins3. Being guided by recent genetic studies4,5,6, we have reconstituted the first eukaryotic ATP-dependent DNA end-resection machinery comprising the Saccharomyces cerevisiae Mre11–Rad50–Xrs2 (MRX) complex, the Sgs1–Top3–Rmi1 complex, Dna2 protein and the heterotrimeric ssDNA-binding protein RPA. Here we show that DNA strand separation during end resection is mediated by the Sgs1 helicase function, in a manner that is enhanced by Top3–Rmi1 and MRX. In congruence with genetic observations6, although the Dna2 nuclease activity is critical for resection, the Mre11 nuclease activity is dispensable. By examining the top3 Y356F allele and its encoded protein, we provide evidence that the topoisomerase activity of Top3, although critical for the suppression of crossover recombination2,7, is not needed for resection either in cells or in the reconstituted system. Our results also unveil a multifaceted role of RPA, in the sequestration of ssDNA generated by DNA unwinding, enhancement of 5′ strand incision, and protection of the 3′ strand. Our reconstituted system should serve as a useful model for delineating the mechanistic intricacy of the DNA break resection process in eukaryotes.

The tumour suppressor complex BRCA1–BARD1 functions in the repair of DNA double-stranded breaks by homologous recombination. During this process, BRCA1–BARD1 facilitates the nucleolytic resection of DNA ends to generate a single-stranded template for the recruitment of another tumour suppressor complex, BRCA2–PALB2, and the recombinase RAD51. Here, by examining purified wild-type and mutant BRCA1–BARD1, we show that both BRCA1 and BARD1 bind DNA and interact with RAD51, and that BRCA1–BARD1 enhances the recombinase activity of RAD51. Mechanistically, BRCA1–BARD1 promotes the assembly of the synaptic complex, an essential intermediate in RAD51-mediated DNA joint formation. We provide evidence that BRCA1 and BARD1 are indispensable for RAD51 stimulation. Notably, BRCA1–BARD1 mutants with weakened RAD51 interactions show compromised DNA joint formation and impaired mediation of homologous recombination and DNA repair in cells. Our results identify a late role of BRCA1–BARD1 in homologous recombination, an attribute of the tumour suppressor complex that could be targeted in cancer therapy. The tumour suppressor complex BRCA1–BARD1, which facilitates the generation of a single-stranded DNA template during homologous recombination, also binds to the recombinase RAD51 and enhances its function. Two of the hereditary breast cancer susceptibility genes (BRCAs) act during the initial stages of recombinational DNA repair. BRCA1, together with BARD1, helps to form the single-stranded DNA that is then bound by another complex, BRCA2–PALB2, which facilitates loading of the central DNA strand exchange factor, RAD51. Patrick Sung and colleagues now show that BRCA1–BARD1 can also directly interact with RAD51 and stimulate the formation of the synaptic complex—a crucial intermediate that aligns the damaged and repair template DNA molecules. Because cancer cells depend on functioning DNA repair to thrive, targeting these factors may provide therapeutic value.

Replication protein A (RPA) is a ubiquitous eukaryotic single-stranded DNA (ssDNA) binding protein necessary for all aspects of DNA metabolism involving an ssDNA intermediate, including DNA replication, repair, recombination, DNA damage response and checkpoint activation, and telomere maintenance [1], [2], [3]. The role of RPA in most of these reactions is to protect the ssDNA until it can be delivered to downstream enzymes. Therefore a crucial feature of RPA is that it must bind very tightly to ssDNA, but must also be easily displaced from ssDNA to allow other proteins to gain access to the substrate. Here we use total internal reflection fluorescence microscopy and nanofabricated DNA curtains to visualize the behavior of Saccharomyces cerevisiae RPA on individual strands of ssDNA in real-time. Our results show that RPA remains bound to ssDNA for long periods of time when free protein is absent from solution. In contrast, RPA rapidly dissociates from ssDNA when free RPA is present in solution allowing rapid exchange between the free and bound states. In addition, the S. cerevisiae DNA recombinase Rad51 and E. coli single-stranded binding protein (SSB) also promote removal of RPA from ssDNA. These results reveal an unanticipated exchange between bound and free RPA suggesting a binding mechanism that can confer exceptionally slow off rates, yet also enables rapid displacement through a direct exchange mechanism that is reliant upon the presence of free ssDNA-binding proteins in solution. Our results indicate that RPA undergoes constant microscopic dissociation under all conditions, but this is only manifested as macroscopic dissociation (i.e. exchange) when free proteins are present in solution, and this effect is due to mass action. We propose that the dissociation of RPA from ssDNA involves a partially dissociated intermediate, which exposes a small section of ssDNA allowing other proteins to access to the DNA.

Abstract Environmental agents like ionizing radiation (IR) and chemotherapeutic drugs can cause severe damage to the DNA, often in the form of double-strand breaks (DSBs). Remaining unrepaired, DSBs can lead to chromosomal rearrangements, and cell death. One major error-free pathway to repair DSBs is homologous recombination repair (HRR). Tousled-like kinase 1 (TLK1), a Ser/Thr kinase that regulates the DNA damage checkpoint, has been found to interact with RAD54, a central DNA translocase in HRR. To determine how TLK1 regulates RAD54, we inhibited or depleted TLK1 and tested how this impacts HRR in human cells using a I Sce -I-GR-DsRed fused reporter endonuclease. Our results show that TLK1 phosphorylates RAD54 at three threonines (T41, T59, and T700), two of which are located within its N-terminal domain (NTD) and one is located within its C-terminal domain (CTD). Phosphorylation at both T41 and T59 supports HRR and protects cells from DNA DSB damage. In contrast, phosphorylation of T700 leads to impaired HRR and engenders no protection to cells from cytotoxicity and rather results in repair delay. Further, our work enlightens the effect of RAD54-T700 (RAD54-CTD) phosphorylation by TLK1 in mammalian system and reveals a new site of interaction with RAD51.

Abstract Homologous recombination (HR) is a complex DNA damage repair pathway and an attractive target of inhibition in anti-cancer therapy. To help guide the development of efficient HR inhibitors, it is critical to identify compensatory sub-pathways. In this study, we describe a novel synthetic interaction between RAD51AP1 and RAD54, two structurally unrelated proteins that function downstream of the RAD51 recombinase in HR. We show that deletion of both RAD51AP1 and RAD54 synergistically sensitizes human cancer cell lines to treatment with a Poly(adenosine 5’ s-diphosphate-ribose) polymerase inhibitor, to the DNA inter-strand crosslinking agent mitomycin C, and to hydroxyurea, which stalls the progression of DNA replication forks. We infer that HR-directed anti-cancer treatment modalities shall consider this intra-pathway functional overlap, and we hypothesize that in cancerous cells the simultaneous inactivation of both RAD54 and RAD51AP1 will accentuate tumor kill.

The Ewing family of sarcomas comprises the fourth most common highly aggressive bone tumor. Four of five Ewing sarcoma chemotherapeutics induce DNA damage, as does radiation therapy. At relapse, two additional DNA-damaging agents are routinely used to re-induce remission, indicating that Ewing sarcoma is intrinsically sensitive to DNA damage. However, current treatment regimens are relatively ineffective, specifically for relapsed or metastatic disease. Several preclinical studies, including our study in the Pediatric Preclinical Testing Program (PPTP), provide evidence for the synthetic lethal combination of PARP1 inhibitor talazoparib with a DNA-methylating agent, temozolomide, for Ewing sarcoma. Nevertheless, in both preclinical studies and clinical trials, doses of temozolomide were significantly reduced because of toxicity of the drug combination. Temozolomide-induced DNA lesions are repaired via poly(ADP) ribose polymerase I (PARP1)-dependent base excision repair and by O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) in a single-step adduct removal. Here, we provide evidence that the two DNA repair pathways act in an epistatic manner in lesion removal. Further, we demonstrate that PARP1 and MGMT physically interact, and that this association is stimulated upon DNA damage. Protein co-immunoprecipitation and microscale thermophoresis analyses revealed that PARP1/MGMT complex formation is DNA and PARylation-independent. Collectively, our results show that: 1) DNA damage response pathways mediated by PARP1 and MGMT work epistatically to eliminate temozolomide-induced DNA adducts; 2) PARP1 and MGMT physically interact; and 3) PARP1/MGMT interaction is increased in response to DNA damage. We discuss how our findings may affect therapeutic advancement for Ewing sarcoma and potentially other cancer types.

Summary Homologous recombination (HR) is essential for the maintenance of genome integrity. Rad51 paralogs fulfill a conserved, but undefined role in HR, and their mutations are associated with increased cancer risk in humans. Here, we use single–molecule imaging to reveal that the Saccharomyces cerevisiae Rad51 paralog complex Rad55–Rad57 promotes the assembly of Rad51 recombinase filaments through transient interactions, providing evidence that it acts as a classical molecular chaperone. Srs2 is an ATP–dependent anti–recombinase that downregulates HR by actively dismantling Rad51 filaments. Contrary to the current model, we find that Rad55– Rad57 does not physically block the movement of Srs2. Instead, Rad55–Rad57 promotes rapid re– assembly of Rad51 filaments after their disruption by Srs2. Our findings support a model in which Rad51 is in flux between free and ssDNA–bound states, the rate of which is dynamically controlled though the opposing actions of Rad55–Rad57 and Srs2.