Abstract Objectives Staphylococcus aureus Smith strain is a historical strain widely used for research purposes in animal infection models for testing the therapeutic activity of antimicrobial agents. We found that it displayed higher sensitivity towards lysocin E, a menaquinone (MK) targeting antibiotic, compared to other S. aureus strains. Therefore, we further explored the mechanism of this hypersensitivity. Methods MK production was analyzed by high-performance liquid chromatography and mass spectrometric analysis. S. aureus Smith genome sequence was completed using a hybrid assembly approach, and the MK biosynthetic genes were compared with other S. aureus strains. The hepT gene was cloned and introduced into S. aureus RN4220 strain using phage mediated recombination, and lysocin E sensitivity was analyzed by the measurement of minimum inhibitory concentration and colony-forming units. Results We found that Smith strain produced MKs with the length of the side chain ranging between 8 – 10, as opposed to other S. aureus strains that produce MKs 7 – 9. We revealed that Smith strain possessed the classical pathway for MK biosynthesis like the other S. aureu s. HepT, a polyprenyl diphosphate synthase involved in chain elongation of isoprenoid, in Smith strain was unique with a Q25P substitution. Introduction of hepT from Smith to RN4220 led to the production of MK-10 and an increased sensitivity towards lysocin E. Conclusions We found that HepT was responsible for the definition of isoprenoid chain length of MKs and antibiotic sensitivity.

Abstract Understanding how a pathogen responds to the host stimuli and succeeds in causing disease is crucial for developing a novel treatment approach against the pathogen. Transcriptomic analysis facilitated by RNA-Seq technologies is used to examine bacterial responses at the global level. However, the ability to understand pathogen behavior inside the host tissues is hindered by much lower pathogen biomass than host tissue. Recently, we succeeded in establishing a method to enrich Staphylococcus aureus cells from infected organs. In this research, we analyzed the small non-coding RNA (sRNA) transcriptome of S. aureus inside the host and found that rsaC was among the highly expressed sRNAs. Furthermore, by gene disruption and complementation, we demonstrated that rsaC was required for full pathogenicity of S. aureus in a murine model. Besides, we found that Δ rsaC showed a difference in gene expression depending on the oxygen and host stress. The findings of this study suggest rsaC acts as a novel virulence factor in S. aureus and might facilitate the adaptation of staphylococci within the host. Importance Drug-resistant Staphylococcus aureus is among the pathogen for which new treatment options are urgently needed. However, limited understanding of S. aureus pathogenesis in the host has hindered unearthing potential strategies to treat the infections. Here, based on the in vivo transcriptomic analysis, we present the identification of a small non-coding RNA (sRNA) rsaC as a novel virulence factor of S. aureus . Furthermore, we performed transcriptomic analysis of the rsaC disrupted mutant and identified different pathways, possibly controlled by rsaC , during aerobic, anaerobic, and in vivo conditions. These findings contribute to reveal the role of sRNA rsaC and broadens our understanding of the adaptation of S. aureus to host environments.

The regulatory network of virulence factors production by Staphylococcus aureus , an opportunistic pathogen, is incompletely understood, and the functions of many uncharacterized genes in its genome remain to be uncovered. We screened 380 function unassigned genes disrupted mutants of the community-acquired methicillin-resistant S. aureus USA300 for pathogenicity using silkworms and identified 11 strains with reduced silkworm killing ability. Nine out of the 11 strains displayed reduced virulence in the mouse model as evidenced by reduced colony-forming units in organs of the infected mice. Three of the identified gene-disrupted mutants had reduced hemolytic activity, one among the three also had reduced proteolytic activity and pigment production. These results suggest that silkworm model could identify the genes required for virulence in the mouse model. The newly identified genes involved in virulence in this study facilitates the further understanding of the pathogenicity of S. aureus .

Abstract Bacillus anthracis is an obligate pathogen and a causative agent of anthrax. Its major virulence factors are plasmid-coded; however, recent studies have revealed chromosome-encoded virulence factors, indicating that the current understanding of its virulence mechanism is elusive and needs further investigation. In this study, we established a silkworm ( Bombyx mori ) infection model of B. anthracis Sterne. We showed that silkworms were killed by B. anthracis and cured of the infection when administered with antibiotics. We quantitatively determined the lethal dose of the bacteria that kills 50% larvae and effective doses of antibiotics that cure 50% infected larvae. Furthermore, we demonstrated that B. anthracis mutants with disruption in virulence genes such as pagA, lef , and atxA had attenuated silkworm-killing ability and reduced colonization in silkworm hemolymph. The silkworm infection model established in this study can be utilized in large-scale infection experiments to identify novel virulence determinants and develop novel therapeutic options against B. anthracis infections.

Abstract Staphylococcus aureus RN4220 has been extensively used by staphylococcal researchers as an intermediate strain for genetic manipulation due to its ability to accept foreign DNA. Despite its wide use in laboratories, its complete genome is not available. In this study, we used the hybrid genome assembly approach using the minION long reads and Illumina short reads to sequence the complete genome of S. aureus RN4220. The comparative analysis of the annotated complete genome showed the presence of 39 genes fragmented in the previous assembly, many of which were located near the repeat regions. Using RNA-Seq reads, we showed that a higher number of reads could be mapped to the complete genome than the draft genome and the gene expression profile obtained using the complete genome also differs from that obtained from the draft genome. Furthermore, by comparative transcriptomic analysis, we showed the correlation between expression levels of staphyloxanthin biosynthetic genes and the production of yellow pigment. This study highlighted the importance of long reads in completing the microbial genomes, especially those possessing repetitive elements.