Abstract Activation of the transcription factor liver X receptor (LXR), has shown to be efficient at curbing aberrant lipid metabolism and inflammation. While small molecule delivery via nanomedicine has promising applications for a number of chronic diseases, there remain questions as to how nanoparticle formulation might be tailored to suit different tissue microenvironments and aid in drug delivery. In the current study, we compared the drug delivery capability of three nanoparticle (NP) formulations encapsulating the LXR activator, GW-3956. We observed little difference in the base characteristics of standard PLGA-PEG NP when compared to two redox-active polymeric NP formulations (DD and DB). Moreover, we also observed similar uptake of these NP into primary mouse macrophages. After an initial acute uptake period and using the transcript and protein expression of the cholesterol efflux protein ATP binding cassette A1 (ABCA1) as a readout, we determined that while the induction of transcript expression was similar between NPs, treatment with the redox-sensitive DB formulation resulted in a higher level of ABCA1 protein 24 h after the removal of the drug-containing NPs. Our results suggest that NP formulations responsive to cellular cues may be an effective tool for targeted and disease-specific drug release.

Abstract Objective The dysregulation of myeloid-derived cell metabolism can drive atherosclerosis. AMP-activated protein kinase (AMPK) controls various aspects of macrophage dynamics and lipid homeostasis, which are important during atherogenesis. Approach and Results We aimed to clarify the role of myeloid-specific AMPK signaling by using LysM-Cre to drive the deletion of both the α1 and α2 catalytic subunits (MacKO), in male and female mice made acutely atherosclerotic by PCSK9-AAV and Western diet-feeding. After 6 weeks of Western diet feeding, half received daily injection of either the AMPK activator, A-769662 or a vehicle control for a further 6 weeks. After 12 weeks, myeloid cell populations were not different between genotype or sex. Similarly, aortic sinus plaque size, lipid staining and necrotic area were not different in male and female MacKO mice compared to their littermate floxed controls. Moreover, therapeutic intervention with A-769662 had no effect. There were no differences in the amount of circulating total cholesterol or triglyceride, and only minor differences in the levels of inflammatory cytokines between groups. Finally, CD68+ area or markers of autophagy showed no effect of either lacking AMPK signaling or systemic AMPK activation. Conclusions Our data suggest that while defined roles for each catalytic AMPK subunit have been identified, global deletion of myeloid AMPK signaling does not significantly impact atherosclerosis. Moreover, we show that intervention with the first-generation AMPK activator, A-769662, was not able to stem the progression of atherosclerosis. Highlights - The deletion of both catalytic subunits of AMPK in myeloid cells has no significant effect on the progression of atherosclerosis in either male or female mice - Therapeutic delivery of a first-generation AMPK activator (A-769662) for the last 6 weeks of 12-week study had no beneficial effect in either male or female mice - Studying total AMPK deletion may mask specific effects of each isoform and highlights the need for targeted disruption of AMPK phosphorylation sites via knock-in mutations, rather than the traditional “sledgehammer” knockout approach

Background and aims Dysregulated cholesterol metabolism is a hallmark of atherosclerotic cardiovascular diseases, yet our understanding of how endogenous cholesterol synthesis affects atherosclerosis is not clear. The energy sensor AMP-activated protein kinase (AMPK) phosphorylates and inhibits the rate-limiting enzyme in the mevalonate pathway HMG-CoA reductase (HMGCR). Recent work demonstrated that when AMPK-HMGCR signaling was compromised in an Apoe-/- model of hypercholesterolemia, atherosclerosis was exacerbated due to elevated hematopoietic stem and progenitor cell mobilization and myelopoiesis. We sought to validate the significance of the AMPK-HMGCR signaling axis in atherosclerosis using a non-germline hypercholesterolemia model with functional ApoE. Methods Male and female HMGCR S871A knock-in (KI) mice and wild-type (WT) littermate controls were made atherosclerotic by intravenous injection of a gain-of-function Pcsk9D374Y-adeno-associated virus followed by high-fat and high-cholesterol atherogenic western diet feeding for 16 weeks. Results AMPK activation suppressed endogenous cholesterol synthesis in primary bone marrow-derived macrophages from WT but not HMGCR KI mice, without changing other parameters of cholesterol regulation. Atherosclerotic plaque area was unchanged between WT and HMGCR KI mice, independent of sex. Correspondingly, there were no phenotypic differences observed in hematopoietic progenitors or differentiated immune cells in the bone marrow, blood, or spleen, and no significant changes in systemic markers of inflammation. When lethally irradiated female mice were transplanted with KI bone marrow, there was similar plaque content relative to WT. Conclusions Given previous work, our study demonstrates the importance of preclinical atherosclerosis model comparison and brings into question the importance of AMPK-mediated control of cholesterol synthesis in atherosclerosis.

Choline is an essential nutrient that is critical component of the membrane phospholipid phosphatidylcholine (PC), the neurotransmitter acetylcholine and the methylation pathway. In the liver specifically, PC is the major membrane constituent and can be synthesized by the CDP-choline or the phosphatidylethanolamine (PE) N-methyltransferase (PEMT) pathway. With the continuing global rise in the rates of obesity and non-alcoholic fatty liver disease, we sought to explore how excess fatty acids (FA), typical of an obesity and hepatic steatosis, affect choline uptake and metabolism in primary hepatocytes. Our results demonstrate that hepatocytes chronically treated with palmitate, but not oleate or a mixture, had decreased choline uptake, which was associated with lower choline incorporation into PC and lower expression of choline transport proteins. Interestingly, a reduction in the rate of degradation spared PC levels in response to palmitate when compared to control. PE synthesis was slightly diminished; however, no compensatory changes in the PEMT pathway were observed. We next hypothesized that ER stress may be a potential mechanism by which palmitate treatment diminished choline. However, when we exposed primary hepatocytes to the common ER stress inducing compound tunicamycin, choline uptake, contrary to our expectation was augmented, concomitant with the transcript expression of choline transporters. Moreover, tunicamycin-induced ER stress divorced the observed increase in choline uptake from CDP-choline pathway flux since ER stress significantly diminished the incorporation and total PC content, similar to PE. Conclusion: Therefore, our results suggest that the altered FA milieu seen in obesity and fatty liver disease progression may adversely affect choline metabolism, but that compensatory mechanisms work to maintain phospholipid homeostasis.

ABSTRACT The dysregulation of macrophage lipid metabolism drives atherosclerosis. AMP-activated protein kinase (AMPK) is a master regulator of cellular energetics and plays essential roles regulating macrophage lipid dynamics. Here, we investigated the consequences of atherogenic lipoprotein-induced foam cell formation on downstream immunometabolic signaling in primary mouse macrophages. A variety of atherogenic low-density lipoproteins (acetylated, oxidized and aggregated forms) activated AMPK signaling in a manner that was in part, due to CD36 and calcium-related signaling. In quiescent macrophages, basal AMPK signaling was crucial for maintaining markers of lysosomal homeostasis, as well as levels of key components in the lysosomal expression and regulation network. Moreover, AMPK activation resulted in targeted up-regulation of members of this network via transcription factor EB. However, in lipid-induced macrophage foam cells, neither basal AMPK signaling nor its activation affected lysosomal-associated programs. These results suggest that while the sum of AMPK signaling in cultured macrophages may be anti-atherogenic, atherosclerotic input dampens the regulatory capacity of AMPK signaling.