Abstract Saul-Wilson syndrome (SWS) is a rare, skeletal dysplasia with progeroid appearance and primordial dwarfism. It is caused by a heterozygous, dominant variant (p.G516R) in COG4, a subunit of the Conserved Oligomeric Golgi (COG) complex involved in intracellular vesicular transport. Our previous work has shown the intracellular disturbances caused by this mutation; however, the pathological mechanism of SWS needs further investigation. We sought to understand the molecular mechanism of specific aspects of the SWS phenotype by analyzing SWS-derived fibroblasts and zebrafish embryos expressing this dominant variant. SWS fibroblasts accumulate glypicans, a group of heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) critical for growth and bone development through multiple signaling pathways. Consistently, we find that glypicans are increased in embryos expressing the COG4 p.G516R variant. These animals show phenotypes consistent with convergent extension (CE) defects during gastrulation, shortened body length, and malformed jaw cartilage chondrocyte intercalation at larval stages. Since non-canonical Wnt signaling was shown in zebrafish to be related to the regulation of these processes by Glypican 4, we assessed wnt levels and found a selective increase of wnt4 transcripts in the presence of COG4 p.G516R . Moreover, overexpression of wnt4 mRNA phenocopies these developmental defects. LGK974, an inhibitor of Wnt signaling corrects the shortened body length at low concentrations but amplifies it at slightly higher concentrations. WNT4 and the non-canonical Wnt signaling component phospho-JNK are also elevated in cultured SWS-derived fibroblasts. Similar results from SWS cell lines and zebrafish point to altered non-canonical Wnt signaling as one possible mechanism underlying SWS pathology.

Background: Congenital heart diseases, such as hypoplastic left heart syndrome (HLHS), are considered to have complex genetic underpinnings that are poorly understood. Here, an integrated multi-disciplinary approach was applied to identify novel genes and underlying mechanisms associated with HLHS. Methods: A family-based strategy was employed that coupled whole genome with RNA sequencing of patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) from an HLHS proband-parent trio to identify, prioritize and functionally evaluate candidate genes in model systems. Results: Consistent with the hypoplastic phenotype, the proband's iPSCs had reduced proliferation capacity. Mendelian inheritance modeling identified 10 genes with recessive rare variants and altered expression compared to the parents' iPSCs. siRNA/RNAi-mediated knockdown in generic human iPSC-derived cardiac progenitors and in the in vivo Drosophila heart model revealed that LDL receptor related protein LRP2 and apolipoprotein APOB are required for robust hiPSC-derived cardiomyocyte proliferation and Drosophila heart function, respectively, possibly involving an oligogenic mechanism via growth-promoting WNT and SHH signaling. Burden analysis of rare damaging variants in the 2 genes and 80 interacting partners in a cohort of 130 HLHS probands and 861 controls identified significant enrichment in LRP2 (p<0.001), a gene associated with poor clinical outcomes in 30% of cases. Conclusions: Collectively, this cross-functional genetic approach to complex congenital heart disease revealed disruption of LRP2 function as a novel genetic driver of HLHS, and hereby established a scalable approach to decipher the oligogenic underpinnings of maladaptive left heart development.

e14634 Background: The combination of immune checkpoint inhibitors (ICIs) with chemotherapy has emerged as a standard first-line treatment strategy for advanced cancers. Camrelizumab and Tislelizumab, representative ICIs, have approval by the Chinese NMPA for first-line treatment of advanced cancers such as lung cancer and esophageal cancer. Previous studies have indicated that the timing of drug administration can influence the efficacy of ICIs. However, studies on the ICIs plus chemotherapy are lacking. Therefore, we conducted a retrospective study to explore the effect of the timing of infusion on patients with advanced cancer undergoing treatment with ICIs combined chemotherapy. Methods: We retrospectively enrolled a total of 253 patients diagnosed with advanced cancers between 2017 and 2023 in Guangdong Second Provincial General Hospital. Among these patients, 109 received camrelizumab (Cam cohort) plus chemotherapy and 65 received tislelizumab (Tis cohort) plus chemotherapy. Patients were grouped into morning (AM) and afternoon (PM) categories based on the timing of their ICIs administration (< 1 times versus ≥ 1 times after 16:00). The Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Criteria V.1.1 was used to evaluate the response to treatment. The primary endpoint was progression-free survival (PFS). Results: The results consistently showed that the PM group had a longer PFS than the AM group in the overall patients (p < 0.01). In the Cam cohort, the PM group (n = 48) exhibited a longer PFS compared to the AM group (n = 61) (16.8 months vs. -, p = 0.02). However, no significant difference in PFS was observed among patients in the Tis cohort (AM vs. PM, n = 34 vs. n = 31, 16.1 months vs. -, p = 0.51). Subgroup analyses indicated that the PM group had a more favorable PFS treatment effect in most subgroups. The incidence of any Treatment Emerged Adverse Event (TEAE) (Cam cohort, AM vs. PM, 98.52% vs. 92.68%; Tis cohort, AM vs. PM, 97.05% vs. 100.00%) and grade 3 TEAEs (Cam cohort, AM vs. PM, 5.80% vs.7.30%; Tis cohort, AM vs.PM - vs. 12.90%) was similar in the Cam cohort and Tis cohort. The most common adverse events are anemia (Cam cohort vs. Tis cohort, 70.58% vs. 79.41%), thrombocytopenia (Cam cohort vs. Tis cohort, 54.41% vs. 58.82%) and lymphopenia (Cam cohort vs. Tis cohort, 44.11% vs. 44.11%). Conclusions: The findings of this study highlight a significant variation in daily rhythms among advanced cancer patients undergoing treatment with ICIs plus chemotherapy. Interestingly, a trend was observed in patients treated with camrelizumab, where those receiving treatment in the afternoon demonstrated a longer PFS. However, this trend was not observed in patients treated with tislelizumab. These results suggest that time-of-day infusion could potentially serve as a personalized strategy for patients treated with combination ICIs therapy.

181 Background: The detection of methylation in circulating free DNA (cfDNA) has become a pivotal approach for the early screening and diagnosis of cancer. Traditional methods, face challenges including high detection limits, inconvenience, and elevated costs. Our prior work developed a rapid, cost-effective, and sensitive electrochemical methylation detection method for multi-cancer early detection (MCED), yet it couldn't identify the tissue of origin (TOO). We aimed to enhance this method by integrating traditional tumor biomarkers with artificial intelligence (AI) algorithms for improved cfDNA methylation detection and rapid TOO determination. Methods: A training cohort of 626 individuals was analyzed, including 173 colorectal cancer (CRC) patients, 49 patients with hematological tumors, 273 patients with other types of tumors, and 131 healthy controls. This analysis utilized electrochemical detection, carcinoembryonic antigen (CEA), and carbohydrate antigen 19-9 (CA19-9). We evaluated the diagnostic performance of these markers using ten types of AI algorithms. The optimal algorithm was selected to construct diagnostic models for CRC and hematological tumors. These models were then validated in an external cohort comprising 100 cancer patients. Results: In the training cohort, the logistic algorithm outperformed others, achieving AUC of 0.915 for CRC, 0.850 for hematological tumors, and 0.860 for other tumors. Based on these results, we opted to utilize the logistic algorithm for the development of diagnostic models for CRC and hematological tumors. The CRC model surpassed the performance of the electrochemical adsorption rate (AUC = 0.817) in CRC, though it showed limited efficacy for hematological tumors (AUC = 0.544) and other tumor types (AUC = 0.806). Conversely, the hematological tumors model achieved its highest performance in hematological tumors (AUC = 0.833), with commendable results for CRC (AUC = 0.831) and other cancers (AUC = 0.799) as well. In the validation cohort, the CRC model accurately identified 32 out of 35 CRC patients, and 17 of these were also detected by the hematological tumors model. Among the hematological tumors patients, 18 out of 20 positive with the hematological tumors model, and 15 were detected by the CRC model. For the remaining 45 patients with various other cancer, 22 tested positive with the CRC model and 28 with the hematological tumors model. Conclusions: Integrating machine learning with electrochemical cfDNA methylation detection and tumor markers provides a powerful approach for accurate cancer detection and TOO determination, promising to improve early diagnosis and personalized treatment strategies.

The extent to which differentiated cells, while remaining in their native microenvironment, can be reprogrammed to assume a different identity will reveal fundamental insight into cellular plasticity and impact regenerative medicine. To investigate in vivo cell lineage potential, we leveraged the zebrafish as a practical vertebrate platform to determine factors and mechanisms necessary to induce differentiated cells of one germ layer to adopt the lineage of another. We discovered that ectopic co-expression of Sox32 and Oct4 in several non-endoderm lineages, including skeletal muscle, can specifically trigger an early endoderm genetic program in a cell-autonomous manner. Gene expression, live imaging, and functional studies reveal that the endoderm-induced muscle cells lose muscle gene expression and morphology, while specifically gaining endoderm organogenesis markers, such as the pancreatic specification genes, hhex and ptf1a, via a mechanism resembling normal development. Endoderm induction by a pluripotent defective form of Oct4, endoderm markers appearing prior to loss of muscle cell morphology, a lack of dependence on cell division, and a lack of mesoderm, ectoderm, dedifferentiation, and pluripotency gene activation, together, suggests that reprogramming is endoderm specific and occurs via direct lineage conversion. Our work demonstrates that within a vertebrate animal, stably differentiated cells can be induced to directly adopt the identity of a completely unrelated cell lineage, while remaining in a distinct microenvironment, suggesting that differentiated cells in vivo may be more amenable to lineage conversion than previously appreciated. This discovery of possibly unlimited lineage potential of differentiated cells in vivo challenges our understanding of cell lineage restriction and may pave the way towards a vast new in vivo supply of replacement cells for degenerative diseases such as diabetes.

Abstract Extracellular glycoprotein Follistatin-like protein 1 (FSTL1) has been reported to be involved in multiple signaling pathways and biological processes during development and disease. In addition, some mouse studies have suggested an inhibitory role of FSTL1 in BMP signaling, in certain context. Yet, whether FSTL1 has biological functions in early heart development are largely unknown. In our functional studies, CRISPR/Cas9 genome editing was used to create fstl1a and fstl1b insertion/deletion mutations in zebrafish and our results suggest that fstl1b is important in regulating heart development during early embryogenesis. in situ hybridization revealed that fstl1b transcripts are expressed in the developing zebrafish heart, and fstl1b homozygous (-/-) mutant exhibited pericardial edema and showed significantly reduced contractility in the ventricle, with incomplete penetrance. We found that zebrafish fstl1b (-/-) mutant hearts formed a collapsed ventricle with strong reductions in the sarcomere structure protein alpha-actinin, although the number of cardiomyocytes was comparable to wild type control siblings. Further, normal levels of fstl1b seems to prevent the expansion of Bmp signaling into ventricular myocytes, which is consistent with the previously established model of Bmp-dependent cardiac contraction. Together these results reveal the zebrafish ortholog fstl1b regulates sarcomere structure and cardiac contractile function. In vertebrate developing heart, it might function as a key component in a novel pathway that constrains Bmp signaling from ventricular myocytes.