Lysine acetylation is a major posttranslational modification involved in a broad array of physiological functions. Here, we provide an organ-wide map of lysine acetylation sites from 16 rat tissues analyzed by high-resolution tandem mass spectrometry. We quantify 15,474 modification sites on 4,541 proteins and provide the data set as a web-based database. We demonstrate that lysine acetylation displays site-specific sequence motifs that diverge between cellular compartments, with a significant fraction of nuclear sites conforming to the consensus motifs G-AcK and AcK-P. Our data set reveals that the subcellular acetylation distribution is tissue-type dependent and that acetylation targets tissue-specific pathways involved in fundamental physiological processes. We compare lysine acetylation patterns for rat as well as human skeletal muscle biopsies and demonstrate its general involvement in muscle contraction. Furthermore, we illustrate that acetylation of fructose-bisphosphate aldolase and glycerol-3-phosphate dehydrogenase serves as a cellular mechanism to switch off enzymatic activity.

Deregulated cellular signalling is a common hallmark of disease, and delineating tissue phosphoproteomes is key to unravelling the underlying mechanisms. Here we present the broadest tissue catalogue of phosphoproteins to date, covering 31,480 phosphorylation sites on 7,280 proteins quantified across 14 rat organs and tissues. We provide the data set as an easily accessible resource via a web-based database, the CPR PTM Resource. A major fraction of the presented phosphorylation sites are tissue-specific and modulate protein interaction networks that are essential for the function of individual organs. For skeletal muscle, we find that phosphotyrosines are over-represented, which is mainly due to proteins involved in glycogenolysis and muscle contraction, a finding we validate in human skeletal muscle biopsies. Tyrosine phosphorylation is involved in both skeletal and cardiac muscle contraction, whereas glycogenolytic enzymes are tyrosine phosphorylated in skeletal muscle but not in the liver. The presented phosphoproteomic method is simple and rapid, making it applicable for screening of diseased tissue samples. The function of proteins is often regulated by their phosphorylation at specific amino-acid residues. The authors of this article have catalogued phosphoproteins and their phosphorylation sites in 14 rat organs and tissues, and provide these data as a resource for researchers.

Importance Atrial fibrillation (AF) has a substantial genetic component. The importance of polygenic risk is well established, while the contribution of rare variants to disease risk warrants characterization in large cohorts. Objective To identify rare predicted loss-of-function (pLOF) variants associated with AF and elucidate their role in risk of AF, cardiomyopathy (CM), and heart failure (HF) in combination with a polygenic risk score (PRS). Design, Setting, and Participants This was a genetic association and nested case-control study. The impact of rare pLOF variants was evaluated on the risk of incident AF. HF and CM were assessed in cause-specific Cox regressions. End of follow-up was July 1, 2022. Data were analyzed from January to October 2023. The UK Biobank enrolled 502 480 individuals aged 40 to 69 years at inclusion in the United Kingdom between March 13, 2006, and October 1, 2010. UK residents of European ancestry were included. Individuals with prior diagnosis of AF were excluded from analyses of incident AF. Exposures Rare pLOF variants and an AF PRS. Main Outcomes and Measures Risk of AF and incident HF or CM prior to and subsequent to AF diagnosis. Results A total of 403 990 individuals (218 489 [54.1%] female) with a median (IQR) age of 58 (51-63) years were included; 24 447 were diagnosed with incident AF over a median (IQR) follow-up period of 13.3 (12.4-14.0) years. Rare pLOF variants in 6 genes ( TTN , RPL3L , PKP2 , CTNNA3 , KDM5B , and C10orf71 ) were associated with AF. Of these, TTN , RPL3L , PKP2 , CTNNA3 , and KDM5B replicated in an external cohort. Combined with high PRS, rare pLOF variants conferred an odds ratio of 7.08 (95% CI, 6.03-8.28) for AF. Carriers with high PRS also had a substantial 10-year risk of AF (16% in female individuals and 24% in male individuals older than 60 years). Rare pLOF variants were associated with increased risk of CM both prior to AF (hazard ratio [HR], 3.13; 95% CI, 2.24-4.36) and subsequent to AF (HR, 2.98; 95% CI, 1.89-4.69). Conclusions and Relevance Rare and common genetic variation were associated with an increased risk of AF. The findings provide insights into the genetic underpinnings of AF and may aid in future genetic risk stratification.

Abstract Aims Glucagon-like peptide-1 receptor agonists (GLP-1 RAs) are increasingly used to treat type 2 diabetes and obesity. Albeit cardiovascular outcomes generally improve, treatment with GLP-1 RAs is associated with increased heart rate, the mechanism of which is unclear. Methods and results We employed a large animal model, the female landrace pig, and used multiple in vivo and ex vivo approaches including pharmacological challenges, electrophysiology, and high-resolution mass spectrometry to explore how GLP-1 elicits an increase in heart rate. In anaesthetized pigs, neither cervical vagotomy, adrenergic blockers (alpha, beta, or combined alpha-beta blockade), ganglionic blockade (hexamethonium), nor inhibition of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide–gated (HCN) channels (ivabradine) abolished the marked chronotropic effect of GLP-1. GLP-1 administration to isolated perfused pig hearts also increased heart rate, which was abolished by GLP-1 receptor blockade. Electrophysiological characterization of GLP-1 effects in vivo and in isolated perfused hearts localized electrical modulation to the atria and conduction system. In isolated sinus nodes, GLP-1 administration shortened the action potential cycle length of pacemaker cells and shifted the site of earliest activation. The effect was independent of HCN blockade. Collectively, these data support a direct effect of GLP-1 on GLP-1 receptors within the heart. Consistently, single nucleus RNA sequencing showed GLP-1 receptor expression in porcine pacemaker cells. Quantitative phosphoproteomics analyses of sinus node samples revealed that GLP-1 administration leads to phosphorylation changes of calcium cycling proteins of the sarcoplasmic reticulum, known to regulate heart rate. Conclusion GLP-1 has direct chronotropic effects on the heart mediated by GLP-1 receptors in pacemaker cells of the sinus node, inducing changes in action potential morphology and the leading pacemaker site through a calcium signalling response characterized by PKA-dependent phosphorylation of Ca2+ cycling proteins involved in pacemaking. Targeting the pacemaker calcium clock may be a strategy to lower heart rate in people treated with GLP-1 RAs.

Abstract Dynamic change in subcellular localization of signaling proteins is a general concept that eukaryotic cells evolved for eliciting a coordinated response to stimuli. Mass spectrometry (MS)-based proteomics in combination with subcellular fractionation can provide comprehensive maps of spatio-temporal regulation of cells, but involves laborious workflows that does not cover the phospho-proteome level. Here we present a high-throughput workflow based on sequential cell fractionation to profile the global proteome and phospho-proteome dynamics across six distinct subcellular fractions. We benchmarked the workflow by studying spatio-temporal EGFR phospho-signaling dynamics in-vitro in HeLa cells and in-vivo in mouse tissues. Finally, we investigated the spatio-temporal stress signaling, revealing cellular relocation of ribosomal proteins in response to hypertonicity and muscle contraction. Proteomics data generated in this study can be explored through https://SpatialProteoDynamics.github.io .

The study of human cardiac pathologies often relies on research conducted in model organisms to gain molecular insight into disease and to develop novel treatment strategies; however, translating findings from model organisms back to human can present a significant challenge, in part due to a lack of knowledge about the differences across species in cardiac protein abundances and their interactions. Here we set out to bridge this knowledge gap by presenting a global analysis of cardiac protein expression profiles in humans and commonly used model organisms. Using quantitative mass spectrometry-based proteomics, we measured the abundance of ~7,000 proteins in samples from the separate chambers of human, pig, horse, rat, mouse and zebrafish hearts. This knowledgebase of cardiac protein signatures is accessible through an online database at: atlas.cardiacproteomics.com. Quantitative comparison of the protein profiles support the pig as model organism of choice for arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy whereas comparison of profiles from the two-chambered zebrafish heart suggests a better resemblance to the right side of mammalian hearts. This proteomics resource facilitates translational prospect of cardiac studies from model organisms to humans by enabling direct comparison of disease-linked protein networks across species.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public Institution(s). Main funding source(s): American Heart Association National Institutes of Health Introduction Atrial arrhythmias, like atrial fibrillation, occur in 20–40% of patients with Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy (ARVC). Atrial fibrillation in ARVC patients is often associated with an increased risk of sustained ventricular arrhythmias and inappropriate ICD shocks. However, the pathophysiology behind the development of atrial arrhythmias in ARVC is far from clear. A genome-wide association study, based on UK-biobank data, revealed a link between atrial fibrillation and variants in the desmosomal gene plakophilin-2 (PKP2). Previous studies show that PKP2 is necessary to maintain the transcription of genes that control intracellular calcium (Ca2+) cycling and that loss of PKP2 expression in adult mouse ventricular tissue leads to disruption of intracellular Ca2+ homeostasis. In this study, we test the hypothesis that loss of PKP2 expression leads to pro-arrhythmic changes in atrial myocytes. Methods Experiments were carried out using a cardiac-specific, tamoxifen (TAM)-activated PKP2 knockout murine model (PKP2-cKO). Cre-negative, flox-positive, TAM-injected littermates were used as controls. We used RNA sequencing, quantitative imaging modalities, as well as biochemical and electrophysiological methods to study the functional and structural properties of atrial PKP2cKO tissue. Studies were carried out 21 days post-tamoxifen injection, a time point at which an arrhythmogenic cardiomyopathy of right ventricular predominance is manifest. Results In contrast to the previously-reported observations in PKP2cKO ventricular myocytes, atrial PKP2cKO myocytes presented no significant differences in Ca2+ transient dynamics, SR load and action potential duration. However, PKP2cKO atrial myocytes showed an increased frequency and amplitude of Ca2+ sparks, in combination with increased diastolic Ca2+ levels as well as an increase in cellular ROS levels. RNAseq data showed an under-representation of mRNA for Integrinα7, a stabilizer of Ryr2 that reduces its phosphorylation. Separate studies showed that PKP2cKO atrial myocytes present impaired relaxation and enhanced sarcomere shortening, a finding consistent with a downregulation in the expression of Myosin Binding Protein C. Isoproterenol (ISO) exposure further increased the frequency of Ca2+ sparks and the levels of diastolic Ca2+, and these effects were reversed by acute (30 minute) in vivo treatment with Ryanodex (medical grade Dantrolene), a known RyR blocker. Conclusion Loss of PKP2 expression affects cellular Ca2+ handling and electrophysiology differently in the atrial versus ventricular myocardium. We speculate that an increased probability of opening of Ryr2 channels, caused by ROS-induced RyR2 oxidation and/or Integrinα7-induced RyR2 phosphorylation, serve as pro-arrhythmic trigger in the PKP2-deficient atrial myocardium, that these effects can be amplified by a catecholaminergic input and that RyR blockers can dampen these pro-arrhythmic effects.