Nosocomial infections that result in the formation of biofilms on the surfaces of biomedical implants are a leading cause of sepsis and are often associated with colonization of the implants by Staphylococcus epidermidis. Biofilm formation is thought to require two sequential steps: adhesion of cells to a solid substrate followed by cell-cell adhesion, creating multiple layers of cells. Intercellular adhesion requires the polysaccharide intercellular adhesin (PIA), which is composed of linear beta-1,6-linked glucosaminylglycans and can be synthesized in vitro from UDP-N-acetylglucosamine by products of the intercellular adhesion (ica) locus. We have investigated a variety of Staphylococcus aureus strains and find that all strains tested contain the ica locus and that several can form biofilms in vitro. Sequence comparison with the S. epidermidis ica genes revealed 59 to 78% amino acid identity. Deletion of the ica locus results in a loss of the ability to form biofilms, produce PIA, or mediate N-acetylglucosaminyltransferase activity in vitro. Cross-species hybridization experiments revealed the presence of icaA in several other Staphylococcus species, suggesting that cell-cell adhesion and the potential to form biofilms is conserved within this genus.

Summary The Staphylococcus epidermidis genes icaABC are involved in the synthesis of the polysaccharide intercellular adhesin (PIA), which is located mainly on the cell surface, as shown by immunofluorescence studies with PIA‐specific antiserum. PIA was shown to be a linear β‐1,6‐linked glucosaminoglycan composed of at least 130 2‐deoxy‐2‐amino‐D‐glucopyrano‐syl residues of which 80–85% are N ‐acetylated, the rest being non‐ N ‐acetylated and positively charged. A transposon insertion in the icaABC gene cluster (ica , intercellular adhesion) led to the loss of several traits, such as the ability to form a biofilm on a polystyrene surface, cell aggregation, and PIA production. The mutant could be complemented by transformation with the IcaABC‐carrying plasmid pCN27. Transfer of pCN27 into the heterologous host Staphylococcus carnosus led to the formation of large cell aggregates, the formation of a biofilm on a glass surface, and PIA expression. The nucleotide sequence of icaABC suggests that the three genes are organized in an operon and that they are co‐transcribed from the mapped ica A promoter. Ica A contains four potential transmembrane helices, indicative of a membrane location. The deduced Ica A sequence shows similarity to those of polysaccharide‐polymerizing enzymes, the most pronounced being with a Rhizobium meliloti N ‐acetylglucosaminyltransferase involved in lipo‐chitin biosynthesis (22.5% overall identity and 37.4% overall similarity). This similarity suggests that Ica A has N‐ acetylglucosaminyltransferase activity in the formation

The polysaccharide intercellular adhesin (PIA) is an important factor in the colonization of medical devices byStaphylococcus epidermidis. The genes encoding PIA production are organized in the icaADBC(intercellular adhesion) operon. To study the function of the individual genes, we have established anin vitro assay with UDP-N-acetylglucosamine, the substrate for PIA biosynthesis, and analyzed the products by thin-layer chromatography and mass spectrometry. IcaA alone exhibited a low N-acetylglucosaminyltransferase activity and represents the catalytic enzyme. Coexpression of icaA withicaD led to a significant increase in activity. The newly identified icaD gene is located between icaAand icaB and overlaps both genes.N-Acetylglucosamine oligomers produced by IcaAD reached a maximal length of 20 residues. Only when icaA andicaD were expressed together with icaC were oligomer chains that react with PIA-specific antiserum synthesized. IcaA and IcaD are located in the cytoplasmic membrane, and IcaC also has all the structural features of an integral membrane protein. These results indicate a close interaction between IcaA, IcaD, and IcaC. Tunicamycin and bacitracin did not affect the in vitrosynthesis of PIA intermediates or the complete PIA biosynthesisin vivo, suggesting that a undecaprenyl phosphate carrier is not involved. IcaAD represents a novel protein combination among β-glycosyltransferases. The polysaccharide intercellular adhesin (PIA) is an important factor in the colonization of medical devices byStaphylococcus epidermidis. The genes encoding PIA production are organized in the icaADBC(intercellular adhesion) operon. To study the function of the individual genes, we have established anin vitro assay with UDP-N-acetylglucosamine, the substrate for PIA biosynthesis, and analyzed the products by thin-layer chromatography and mass spectrometry. IcaA alone exhibited a low N-acetylglucosaminyltransferase activity and represents the catalytic enzyme. Coexpression of icaA withicaD led to a significant increase in activity. The newly identified icaD gene is located between icaAand icaB and overlaps both genes.N-Acetylglucosamine oligomers produced by IcaAD reached a maximal length of 20 residues. Only when icaA andicaD were expressed together with icaC were oligomer chains that react with PIA-specific antiserum synthesized. IcaA and IcaD are located in the cytoplasmic membrane, and IcaC also has all the structural features of an integral membrane protein. These results indicate a close interaction between IcaA, IcaD, and IcaC. Tunicamycin and bacitracin did not affect the in vitrosynthesis of PIA intermediates or the complete PIA biosynthesisin vivo, suggesting that a undecaprenyl phosphate carrier is not involved. IcaAD represents a novel protein combination among β-glycosyltransferases. In recent years, Staphylococcus epidermidis has emerged as a frequent cause of nosocomial infections in association with indwelling medical devices such as intravascular catheters, cerebrospinal fluid shunts, prosthetic heart valves, prosthetic joints, artificial pacemakers, and chronic ambulatory peritoneal dialysis catheters (reviewed in Refs. 1Christensen G.D. Baldassarri L. Simpson W.A. Bisno A.L. Waldvogel F.A. Infections Associated with Indwelling Medical Devices. 2nd Ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C.1994: 45-78Google Scholar and 2Rupp M.E. Archer G.D. Clin. Infect. Dis. 1994; 19: 231-245Crossref PubMed Scopus (428) Google Scholar). The virulence of S. epidermidis in these infections is thought to be based on its ability to colonize medical devices by forming a biofilm composed of multilayered cell clusters embedded in a slime matrix (3Ludwicka A. Uhlenbruck G. Peters G. Seng P.N. Gray E.D. Jeljaszewicz J. Pulverer G. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A. 1984; 258: 256-267PubMed Google Scholar). As shown by electron microscopy studies, surface colonization takes place in two steps (4Peters G. Locci R. Pulverer G. Zentralbl. Bakteriol. Abt. 1 Orig. B Hyg. Krankenhaushyg. Betriebshyg. Praev. Med. 1981; 172: 293-299Google Scholar). The first step is primary adhesion of some bacteria, which is followed by proliferation of the cells to multilayered clusters. Factors reported to contribute to primary attachment of S. epidermidis cells to a polymer surface include unspecific hydrophobic interactions (5Ludwicka A. Jansen B. Wadström T. Pulverer G. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A. 1984; 256: 479-489PubMed Google Scholar, 6Pascual A. Fleer A. Westerdaal N.A.C. Verhoef J. Eur. J. Clin. Microbiol. 1986; 5: 518-522Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar), a capsular polysaccharide/adhesin (PS/A) (7Tojo M. Yamashita N. Goldmann D.A. Pier G.B. J. Infect. Dis. 1988; 157: 713-722Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar, 8Muller E. Hübner J. Gutierrez N. Takeda S. Goldmann D.A. Pier G.B. Infect. Immun. 1993; 61: 551-558Crossref PubMed Google Scholar), proteinaceous cell-surface antigens (SSP-1 and SSP-2) (9Timmerman C.P. Fleer A. Besnier J.M. de Graaf L. Cremers F. Verhoef J. Infect. Immun. 1991; 59: 4187-4192Crossref PubMed Google Scholar, 10Veenstra G.J.C. Cremers F.F.M. van Dijk H. Fleer A. J. Bacteriol. 1996; 178: 537-541Crossref PubMed Scopus (134) Google Scholar), and the autolysin AtlE identified by our group (11Heilmann C. Hussain M. Peters G. Götz F. Mol. Microbiol. 1997; 24: 1013-1024Crossref PubMed Scopus (585) Google Scholar). A characteristic feature of the second phase of biofilm formation is intercellular adhesion, which results in the formation of large cell clusters by clinical S. epidermidis strains. This reaction is associated with the production of the polysaccharide intercellular adhesin (PIA) 1The abbreviations used are: PIA, polysaccharide intercellular adhesin; MBP, maltose-binding protein; HPTLC, high performance thin-layer chromatography; HPLC, high performance liquid chromatography; MS, mass spectrometry. located at the cell surface (12Mack D. Nedelmann M. Krokotsch A. Schwarzkopf A. Heesemann J. Laufs R. Infect. Immun. 1994; 62: 3244-3253Crossref PubMed Google Scholar). PIA consists of two structurally related homoglycans, polysaccharides I and II, composed of at least 130 2-deoxy-2-amino-d-glucopyranosyl residues that are mostly (>80%) N-acetylated. The residues are β-1,6-linked (13Mack D. Fischer W. Krokotsch A. Leopold K. Hartmann R. Egge H. Laufs R. J. Bacteriol. 1996; 178: 175-183Crossref PubMed Scopus (706) Google Scholar), a type of linkage for N-acetylglucosamine polymers that has not been previously described. In addition, a 140-kDa extracellular protein that is missing in an accumulation-negative mutant of S. epidermidis RP62A is thought to contribute to intercellular adhesion (14Hussain M. Herrmann M. von Eiff C. Perdreau-Remington F. Peters G. Infect. Immun. 1997; 65: 519-524Crossref PubMed Google Scholar, 15Schumacher-Perdreau F. Heilmann C. Peters G. Götz F. Pulverer G. FEMS Microbiol. Lett. 1994; 117: 71-78Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). Recently, we cloned and sequenced three S. epidermidis RP62A genes (icaABC) that are involved in intercellular adhesion and PIA production (16Heilmann C. Schweitzer O. Gerke C. Vanittanakom N. Mack D. Götz F. Mol. Microbiol. 1996; 20: 1083-1091Crossref PubMed Scopus (776) Google Scholar). Transposon insertion mutants in theica operon of S. epidermidis O-47 (class B mutants) (17Heilmann C. Gerke C. Perdreau-Remington F. Götz F. Infect. Immun. 1996; 64: 277-282Crossref PubMed Google Scholar, 18Heilmann C. Götz F. Zentralbl. Bakteriol. 1998; 287: 69-83Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar) are unable to form a biofilm on various surfaces. It has also been shown that the majority of S. epidermidisstrains isolated from septicemic patients were biofilm-positive, whereas skin and mucosal isolates were not, even though the genome of the biofilm-forming strains contained the ica genes (19Ziebuhr W. Heilmann C. Götz F. Meyer P. Wilms K. Straube E. Hacker J. Infect. Immun. 1997; 65: 890-896Crossref PubMed Google Scholar). Here, we report the identification of a fourth gene (icaD) that is located within the ica operon and that is necessary for PIA synthesis. Furthermore, we demonstrate that IcaA and IcaD are located in the membrane and together exhibitN-acetylglucosaminyltransferase activity, in which IcaA represents the catalytic enzyme that requires IcaD for full activity. Finally, we show that in addition to icaA andicaD, icaC is essential for long-chain PIA synthesis. DNA containingica was isolated from PIA-producing and biofilm-positiveS. epidermidis RP62A (ATCC 35984). The Staphylococcus carnosus wild-type strain TM300 (20Götz F. J. Appl. Bacteriol. Symp. Suppl. 1990; : 49-53Crossref Scopus (90) Google Scholar) was used as cloning host for all staphylococcal plasmids and for heterologous expression ofica genes. Cloning in Escherichia coli and the production of maltose-binding protein fusions were performed inE. coli strain TB1 (ara Δ(lac proAB)rpsL (f80 lacZΔM15) hsdR) obtained from New England Biolabs (Schwalbach, Germany). Staphylococci were grown in tryptic soy broth (Difco, Augsburg, Germany) or in LB medium (1% Tryptone (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), and 0.5% NaCl), which was also used to cultivate E. coli. When appropriate, the media were supplemented with tetracycline (10 μg/ml), chloramphenicol (10 μg/ml), or ampicillin (100 μg/ml). DNA manipulations, plasmid DNA isolation, and transformation of E. coli were performed using standard procedures (21Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). To isolate DNA from staphylococci, cells were lysed by adding 0.1 mg/ml lysostaphin (Sigma, Deisenhofen, Germany), and the alkaline lysis method was subsequently applied. Chromosomal staphylococcal DNA was prepared according to the procedure of Marmur (22Marmur J. J. Mol. Biol. 1961; 3: 202-218Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar). S. carnosus was transformed with plasmid DNA by protoplast transformation (23Götz F. Schumacher B. FEMS Microbiol. Lett. 1987; 40: 285-288Crossref Scopus (138) Google Scholar). Polymerase chain reaction experiments were performed with Vent DNA polymerase (New England Biolabs) as recommended by the manufacturer. DNA sequences were determined using the Sequenase protocol (Version 2.0, Amersham, Braunschweig, Germany) or a LI-COR DNA sequencer (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany). The primers for polymerase chain reaction were as follows: primer 4, ATGCATGTATTTAACTTTTTACTTTTC; primer 5, TCGACGCGTGATATAGTAATAAATAAGCTCTCCC; primer 18, CGGGATCCAGGAGGTGAAAAAATGCATGTATTT; primer 23, TCGACGCGTTTGAAAGGTTTCATATGTCACG; primer 25, CGGGATCCAAGAAAGAAAGGTGGCTATGC; primer 33, GAAGATCTCATGGTCAAGCCCAGA; primer 34, GAAGATCTCATCAATGCGCTAATAAAG; primer S1, AAAAAGGCGCCGGGACTTTTTTTATTAATTCCAGTTAGGC; primer S2, TTTTTAGATCTCGCGTTTCAAAAATATAAGAAAGGTCGTG; primer S8, AATAAGGGACGCGTTTTATTAATTCCAG; primer S12, GCTTTAGATCTTAACTAACGAAAGGTAGG; and primer S15, CGATGATTATGACACAAATAAACACGCGTAAATACAC. Restriction sites are underlined. In this study, theica genes were amplified by polymerase chain reaction from chromosomal DNA of S. epidermidis RP62A and cloned independently or in various combinations in the inducible staphylococcal expression vectors pTX15 (24Peschel A. Götz F. J. Bacteriol. 1996; 178: 531-536Crossref PubMed Google Scholar) and pCX19, a derivative of pCX15 (25Wieland K.-P. Wieland B. Götz F. Gene ( Amst. ). 1995; 158: 91-96Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). Gene expression was induced by adding 0.5% xylose (final concentration) to the growth medium (LB medium) atA 578 nm = 0.4 and further incubation of the strains for 6 h. The restriction sites used for the construction of the following plasmids are indicated in parentheses: pTXicaA carries icaA amplified using primers 18 and 5 (BamHI-MluI); pCXicaD containsicaD amplified using primers 25 and 23 (BamHI-SmaI); pTXicaAD harborsicaA and icaD amplified using primers 18 and 23 (BamHI-MluI); pTXicaADBC contains the entire ica operon amplified using primers S12 and S8 (BglII-MluI); pTXicaADB carriesicaA, icaD, and icaB amplified using primers S12 and S15 (BglII-MluI); and pTXicaBC contains icaB and icaCamplified using primers S2 and S1 (BglII-NarI). pTXicaADC was obtained by generating a frameshift deletion mutation of icaB in pTXicaADBC as described for the inactivation of icaB in pCN27 (16Heilmann C. Schweitzer O. Gerke C. Vanittanakom N. Mack D. Götz F. Mol. Microbiol. 1996; 20: 1083-1091Crossref PubMed Scopus (776) Google Scholar). The plasmid pTX16 (24Peschel A. Götz F. J. Bacteriol. 1996; 178: 531-536Crossref PubMed Google Scholar) was used as a negative control. Fusions of icaA and icaD with malEwere constructed using the vector pIH902 (New England Biolabs), a derivative of pMAL-c2. The icaA gene was amplified using primers 4 and 5, cleaved with AccI, treated with Klenow enzyme, and inserted into the StuI site of pIH902, yielding the plasmid pIHicaA300, encoding the first 306 amino acids of IcaA. pIHicaD carries icaD amplified using primers 33 and 34 and blunt end-inserted into the StuI site of pIH902. Staphylococcus and E. colicultures were harvested by centrifugation, and the cell pellets were resuspended in buffer A (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 10 mm MgCl2, and 4 mm dithiothreitol; 2 μl/mg of cell wet weight). The cells were disrupted by 3 × 1-min vortexing in Corex tubes with glass beads (diameter of 0.15–0.30 mm; 4.5 times the weight of the cell pellet). DNase I (20 μg/ml; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) was added before breaking the cells. Unbroken cells and glass beads were sedimented (10 min, 2000 × g), and the supernatant was saved. The procedure was repeated one to three times; all supernatants were combined. Membranes were sedimented from the crude extract by ultracentrifugation (20 min, 200,000 × g) and resuspended in buffer A at a protein concentration of 5 mg/ml (5-fold concentration of the membrane proteins over the crude extract). The collected membranes were called “crude membranes.” For further purification, the crude membranes were extracted with 2% (w/v) Triton X-100 (in buffer A) for 2 h with gentle shaking, sedimented again, washed once with buffer A, and resuspended in the same volume of buffer A as the crude membranes. These preparations were designated “Triton-extracted membranes.” The membranes were stored at −70 °C. Protein concentrations were determined by the method of Bradford (47Bradford M.M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254Crossref PubMed Scopus (225068) Google Scholar). E. coli TB1 carrying pIHicaA300 or pIHicaD was used to express the malE gene fusions. The soluble maltose-binding protein (MBP) fusion protein MBP-IcaA300 was purified according to Ref. 45New England BiolabsProtein Fusion and Purification System Manual. New England Biolabs, Schwalbach, Germany1990Google Scholar. The very poorly produced fusion protein MBP-IcaD was located in the membrane fraction, from where it was solubilized as described above using 2% (w/v) Triton X-100 and 500 mmNaCl. The MBP-IcaD-containing fraction was diluted to a final Triton X-100 concentration of 0.5% and incubated for 12 h with amylose resin equilibrated with column buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 500 mm NaCl, and 10 mm EDTA) containing 0.5% Triton X-100. The amylose material was collected by centrifugation (10 min, 2000 × g) and washed. MBP-IcaD was eluted with 10 mm maltose in column buffer. Rabbits were immunized with the purified MBP fusion proteins at Eurogentech (Seraing, Belgium) according to their standard immunization program. The antiserum obtained against MBP-IcaA300 was designated anti-IcaA; the antiserum obtained against MBP-IcaD was designated anti-IcaD. To block unspecific binding of the antisera and secondary conjugates used in immunoblot analyses, these were diluted 1:250 in Tris-buffered saline, 0.1% bovine serum albumin, and 1 mm sodium azide and incubated with a crude extract from S. carnosus pTX16 (final protein concentration of 0.5 mg/ml). After 12 h of gentle shaking, precipitated material was sedimented by centrifugation (30 min, 30,000 × g). Proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis according to Laemmli (46Laemmli U.K. Nature. 1970; 227: 680-685Crossref PubMed Scopus (218068) Google Scholar) and either stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma) or electrophoretically transferred to a nitrocellulose membrane (BA83, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) using a semidry apparatus. IcaA was detected by the anti-IcaA antiserum and IcaD by the anti-IcaD antiserum (1:1000). Subsequently, the nitrocellulose membranes were incubated with anti-rabbit immunglobulin G-biotin conjugate (1:5000; Sigma) and with streptavidin-horseradish peroxidase complex (1:5000; Amersham). Immunoreactive proteins were visualized by enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham) with Fuji HR-E30 films. Reprobing of a blot with another primary antiserum was performed according to the ECL Western blotting protocol. PIA production in vivo was analyzed in crude extracts and in cell-surface extracts obtained by incubating the cells in 0.5m EDTA, pH 8.0, for 5 min at 100 °C. For production experiments in the presence of antibiotics, tunicamycin (5–20 μg/ml) and bacitracin (50–400 μg/ml) were added to cultures of S. carnosus pTXicaADBC at the time of induction. PIA production in vitro was determined in the enzymatic assays. Extracts (1 μl each) were applied to a nitrocellulose membrane (BA83) using the Bio-Dot Microfiltration apparatus (Bio-Rad, München, Germany). PIA was detected with the PIA-specific antiserum (1:5000) (16Heilmann C. Schweitzer O. Gerke C. Vanittanakom N. Mack D. Götz F. Mol. Microbiol. 1996; 20: 1083-1091Crossref PubMed Scopus (776) Google Scholar). Bound PIA antibodies were visualized by anti-rabbit immunglobulin G-alkaline phosphatase conjugate (1:5000; Sigma) and color reaction. In vitro reactions to analyze glycosyltransferase activity were performed by incubating crude extracts (see above) with 0.4 mm UDP-N-acetylglucosamine or crude membranes or Triton-extracted membranes (see above) with 2 mm UDP-N-acetylglucosamine. In vitrosynthesis of peptidoglycan was repressed by adding 50 μg/mld-cycloserine (26Lugtenberg E.J.J. de Haas-Menger L. Ruyters W.H.M. J. Bacteriol. 1972; 109: 326-335Crossref PubMed Google Scholar). For radiolabeling, 10 μmUDP-N-acetyl-d-[U-14C]glucosamine (final radioactive concentration of 84 Bq (2.3 nCi)/μl of reaction volume; Amersham) was added. Analytical reactions were carried out in a total volume of 10–50 μl. Reaction mixtures were incubated for 12 h at 20 °C. To test other substrates, UDP-glucose, UDP-galactose, and UDP-glucuronic acid (14C-labeled substrates from Amersham) were used in equimolar amounts. For experiments in the presence of tunicamycin and bacitracin, the antibiotics were added in the above-mentioned concentrations. For thin-layer chromatography, in each case, 1 μl of in vitro reaction assays containing14C-labeled UDP-N-acetylglucosamine was applied to NH2-HPTLC plates (Merck, Darmstadt, Germany). The chromatogram was developed twice using acetonitrile/water (60:40 or 65:35, v/v). Radioactive spots were detected by phosphoimaging with a Fuji BAS 1500 (Raytest, Straubenhardt, Germany) or by autoradiography. Fuji HR-E30 films were exposed for 6–10 weeks. As a reference compound,N-acetyl-d-[1-14C]glucosamine (25 Bq) or unlabeled N-acetylglucosamine (10 μg) was used. If appropriate, 0.005% Triton X-100 was added. The unlabeled standard was visualized by spraying with 0.2% orcinol in H2SO4 and subsequent heating at 100 °C for 15 min. For HPLC analysis of the in vitro synthesized products, the pH of the reaction assays was lowered to 4.5 with phosphoric acid; the samples were heated for 5 min at 100 °C; and the precipitated material was sedimented by centrifugation (10 min, 13,000 ×g). Acetonitrile was added to the supernatant to a final concentration of 75%. The products were separated on a Nucleosil 120-7-NH2-HPLC column (4.6 × 250 mm; Bischoff, Leonberg, Germany) and eluted with an acetonitrile gradient in pure water from 75 to 50% acetonitrile over 45 min at a flow rate of 1 ml/min. Subsequently, the column was washed for 10 min with pure water. Elution was monitored by determining A 205 nm. Radiolabeled products were detected by measuring 14C using a flow counter (Packard Instrument Co.). Electrospray mass spectra were recorded on a triple-quadrupole mass spectrometer Model API III (mass range of m/z 10–2400) equipped with a pneumatic supplied electrospray (“ion spray”) interface (Sciex, Thornhill, Ontario, Canada). The mass spectrometer was operated in positive ion mode under unit mass resolution conditions for all determinations. The potential of the spray needle was kept at 4.8 kV; the orifice voltage was +80 V. For mass calibration, a solution of polypropylene glycol was used. Unlabeled IcaAD-dependent products synthesized in vitro were applied to the mass spectrometer by HPLC/MS coupling injecting 100 μl/min into the mass spectrometer. To analyze the biosynthesis of the N-acetylglucosamine polymer PIA, theica genes were expressed under the control of the xylose-inducible promoter of the pTX15 expression vector (24Peschel A. Götz F. J. Bacteriol. 1996; 178: 531-536Crossref PubMed Google Scholar) independently and in various combinations in S. carnosus. Glycosyltransferase activity was studied by incubating crude extracts or cell fractions of these clones with UDP-N-acetylglucosamine, the putative substrate forN-acetylglucosamine oligomer synthesis. In these experiments, evident transferase activity was detected whenicaA and the intergenic region between icaA andicaB were expressed in S. carnosus. This region harbors a small open reading frame whose relevance was, until then, unclear. The gene was designated icaD (Fig. 1). The icaD gene is 306 nucleotides long and is transcribed in the same direction as the icaABC genes. The start oficaD overlaps with the end of icaA by 37 nucleotides (Fig. 1), and the end of icaD overlaps with the start of icaB by 4 nucleotides. The deduced polypeptide oficaD consists of 101 amino acids with a calculated molecular mass of 11,953 Da and a pI of 9.88. IcaD contains 54.5% hydrophobic amino acids, and two transmembrane helices are predicted. Similarity searches in data bases revealed no sequence similarity of IcaD to known proteins. Inactivation of icaD in a plasmid containing the complete ica operon led to the loss of cell aggregation and PIA production in S. carnosus (data not shown), indicating that, in addition to icaABC, icaD plays an essential role in intercellular adhesion and PIA production in vivo. To determine the localization of IcaA and IcaD, antisera against maltose-binding protein fusions of IcaA and IcaD were raised in rabbits. By Western blot analyses, the presence of IcaA and IcaD was analyzed in various cell fractions from induced S. carnosus pTXicaAD cells. For detailed studies, the membrane fraction was divided into crude membranes (membranes derived from the crude extract by ultracentrifugation) and Triton-extracted membranes (crude membranes purified by Triton X-100 extraction). The anti-IcaA antiserum reacted with a 38-kDa protein present in the crude extract, the crude membranes, and the Triton-extracted membranes, but not with any protein in the cytosolic fraction or the soluble fraction obtained from Triton X-100 extraction (Fig. 2 A). No reaction of the antiserum was observed with Triton-extracted membranes from uninducedS. carnosus pTXicaAD or from S. carnosus pTX16 (24Peschel A. Götz F. J. Bacteriol. 1996; 178: 531-536Crossref PubMed Google Scholar) carrying the vector alone, indicating that the reaction of the antiserum was IcaA-specific. The IcaD-specific antiserum reacted with a 34-kDa protein that was present in the same fractions as IcaA (Fig. 2 B). Thus, both IcaA and IcaD are membrane-bound. IcaA and IcaD exhibited very similar apparent molecular masses in the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analyses. We therefore reprobed the blot that was analyzed with the IcaD-specific antiserum with the anti-IcaA antiserum to confirm that IcaA and IcaD are independent proteins. The result (Fig. 2 C) clearly showed that the two antisera recognize different proteins. The glycosyltransferase activity of IcaAD was analyzed in crude extracts and membranes from S. carnosus pTXicaAD. As a negative control, extracts from S. carnosus pTX16 were used. Products synthesized in vitro from UDP-N-acetylglucosamine (5–25% of the applied substrate was 14C-labeled) were analyzed by HPTLC on NH2-HPTLC plates (Fig. 3). With crude extract, crude membranes, and Triton-extracted membranes from induced S. carnosus pTXicaAD, but not with the cytosolic fraction or the soluble fraction obtained from Triton X-100 extraction, radiolabeled products were formed that were separated in a ladder-like series. This ladder strongly suggested that the products represent oligomers with an increasing number of residues. No such products were synthesized with extracts from S. carnosus pTX16 cells (Fig. 3) or extracts from uninduced S. carnosus pTXicaAD cells (data not shown), indicating that the observed transferase activity was due to icaA andicaD. When UDP-glucose, UDP-galactose, and UDP-glucuronic acid, which often function as substrates for the biosynthesis of exopolymers, were tested, we obtained no ladder of products (data not shown). The migration rates of the products synthesized with crude membranes and Triton-extracted membranes were different. Since the migration rate of the reference compound N-acetylglucosamine differed as well after addition of Triton X-100 (0.005%, w/v), as indicated in Fig. 3, the deviation is probably due to the Triton X-100 remaining in the Triton-extracted membrane preparation. These data were supported by mass spectrometric analyses, in which the oligomers synthesized with Triton-extracted membranes were found to be associated with Triton X-100 molecules (data not shown). The mass spectrometric analyses were performed to further characterize the in vitro synthesized reaction products. For these analyses, the products were separated by HPLC. The elution profile of the IcaAD-dependent products from Triton-extracted membranes, recorded by analyzing 10 μl of radiolabeled assay mixtures, is shown in Fig. 4. HPLC separation was performed on an NH2-HPLC column using an acetonitrile gradient. The HPLC separation system was comparable to the NH2-HPTLC system. By isolating the eluted compounds and analyzing them again by HPTLC, we found that the succession of the eluted IcaAD-dependent products was the same in HPLC and HPTLC analyses (data not shown). The numbers of the spots in the high performance thin-layer chromatogram (Fig. 3) and the peaks in the high performance liquid chromatogram (Fig. 4) correspond to identical substances. In the electrospray mass spectrometric analyses of nonradioactive products synthesized with Triton-extracted membranes, spectra of the substances eluting as peaks 1–8 were recorded. They revealed molecular ions at m/z 204, 407, 610, 813, 1016, 1219, 1422, and 1625 (Fig. 4). These values correspond to the [M + H]+pseudo-molecular ions of a monomer to octamer ofN-acetylglucosamine lacking one water residue/sugar chain since the displayed ions were 18 mass units smaller than the calculated [M + H]+ pseudo-molecular ions of the fully hydratedN-acetylglucosamine monomer to octamer (m/z 222, 425, 628, 831, 1034, 1237, 1440, and 1643). The mass spectrometric analyses of the products synthesized with crude membranes revealed that different kinds of oligomers were formed with this membrane preparation and that the TLC and HPLC systems used were not capable of separating all of the formed products. In the analyses of the products M2, M4, M6, and M8–12 (Fig. 3), ions were obtained that corresponded to two different N-acetylglucosamine oligomers. The ions at m/z 204, 407, 610, 813, 1016, 1219, 1422, and 1625 represent the [M + H]+ pseudo-molecular ions of the putative anhydrous monomer to octamer ofN-acetylglucosamine that were also formed with Triton-extracted membranes; the ions at m/z 222, 425, 628, 831, 1034, 1237, 1440, and 1643 correspond to the fully hydratedN-acetylglucosamine monomer to octamer. The ladder of these products is indicated in Figs. 3 and 6. The ion of product M1 was detected at m/z 325, and in substances M3–9, additional ions at m/z 528, 731, 934, 1137, 1340, 1543, and 1746 were detected. These ions probably represent the [M + H]+pseudo-molecular ions of the monomer to octamer ofN-acetylglucosamine carrying a modification with a mass of 103. None of the MS analyses of the in vitro products from crude membranes and Triton-extracted membranes revealed deacetylatedN-acetylglucosamine residues, which compose 15–20% of the major polysaccharide I of PIA (13Mack D. Fischer W. Krokotsch A. Leopold K. Hartmann R. Egge H. Laufs R. J. Bacteriol. 1996; 178: 175-183Crossref PubMed Scopus (706) Google Scholar). Bacterial exopolysaccharides are often synthesized on an undecaprenyl phosphate lipid carrier (27Bugg T.D.H. Brandish P.E. FEMS Microbiol. Lett. 1994; 119: 255-262Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). We therefore investigated whether a lipid carrier is involved in the synthesis of the IcaAD metabolites. Attempts to isolate lipid-linked intermediates in vitro or in vivo according to the method of Bligh and Dyer (28Bligh E.G. Dyer W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 1959; 37: 911-917Crossref PubMed Scopus (44552) Google Scholar) failed. Furthermore, the antibiotics tunicamycin and bacitracin, which affect undecaprenyl phosphate-mediated syntheses, had no effect on eitherin vitro oligomer synthesis or in vivo PIA production (data not s

Abstract In light of the expanding SARS-CoV-2 pandemic, developing efficient vaccines that can provide sufficient coverage for the world population is a global health priority. The measles virus (MV)-vectored vaccine is an attractive candidate given the measles vaccine’s extensive safety history, well-established manufacturing process, and induction of strong, long-lasting immunity. We developed an MV-based SARS-CoV-2 vaccine using either the full-length spike (S) or S2 subunit as the antigen. While the S2 antigen failed to induce neutralizing antibodies, the prefusion-stabilized, full-length S (MV-ATU2-SF-2P-dER) construct proved to be an attractive vaccine candidate, eliciting strong Th1-dominant T-cell and neutralizing antibody responses against the S antigen while minimizing reactivity to the vector itself. Neutralizing antibody titers remained high three months after homologous prime-boost immunization, and infectious virus was undetectable in all animals after challenge with a mouse-adapted SARS-CoV-2 virus.

A single oral inoculation to mice of the live attenuated Yersinia pseudotuberculosis VTnF1 strain producing an F1 pseudocapsule protects against bubonic and pneumonic plague. However oral vaccination can fail in humans exposed to frequent intestinal infections. We evaluated in mice the efficacy of subcutaneous vaccine injection as an alternative way to induce protective immunity, while reducing the dose and avoiding strain release in nature. A single subcutaneous dose of up to 108 CFU induced dose-dependent antibody production. At the dose of 107 CFU, i.e. 10 times less than via the oral route, it caused a modest skin reaction and protected 100% against bubonic and 80% against pneumonic plague, caused by high doses of Yersinia pestis. Bacteria migrating to lymph nodes and spleen, but not feces, were rapidly eliminated. Thus, subcutaneous injection of VTnF1 would represent a good alternative when dissemination in nature and human intestinal responsiveness are limitations.

Abstract The causative agent of plague, Yersinia pestis , remains a treat for public health worldwide. In the perspective to develop effective and safe vaccines, we present here a derived version of our Y. pseudotuberculosis VTnF1 live attenuated vaccine candidate that lacks the pYV virulence plasmid coding for the Type 3 Secretion system (T3SS) and no antibiotic resistance cassettes. This strain, called VpYV-, was safe for immunodeficient mice, and thus can be considered as deeply attenuated. It still has tropism for lymphatic tissues (Peyer’s patches, Mesenteric lymph nodes) but hardly reaches the spleen and liver. It elicits IgG to the F1 antigen as efficiently as VTnF1 but less directed to other Yersinia antigens. A single oral dose induced 100% protection against bubonic and pneumonic forms of plague, but this protection decreased faster with time than that of VTnF1. In the same line, VpYV-was 30% less protective against a F1-negative Y. pestis , revealing that the tools encoded by pYV are mandatory to obtain a large spectrum protection. Finally, VTnF1 like the Y. pestis vaccine EV76 can induce protection against co-infected Y. pestis relying on ‘host iron nutritional immunity”, indicating a potential use as therapeutics of recent infection. In contrast VpYV-failed to do so, revealing an importance of the T3SS in this mechanism. Overall, VpYV- and its parental strain VTnF1 offer a choice between more attenuation and safety or vaccine performances. They give an alternative and may represent useful tools to prevent and treat Y. pestis infection in healthy or immunosuppressed individuals.

Abstract As the COVID-19 pandemic continues and new SARS-CoV-2 variants of concern emerge, the adaptive immunity initially induced by the first-generation COVID-19 vaccines wains and needs to be strengthened and broadened in specificity. Vaccination by the nasal route induces mucosal humoral and cellular immunity at the entry point of SARS-CoV-2 into the host organism and has been shown to be the most effective for reducing viral transmission. The lentiviral vaccination vector (LV) is particularly suitable for this route of immunization because it is non-cytopathic, non-replicative and scarcely inflammatory. Here, to set up an optimized cross-protective intranasal booster against COVID-19, we generated an LV encoding stabilized Spike of SARS-CoV-2 Beta variant (LV::S Beta-2P ). mRNA vaccine–primed and -boosted mice, with waning primary humoral immunity at 4 months post-vaccination, were boosted intranasally with LV::S Beta-2P . Strong boost effect was detected on cross-sero-neutralizing activity and systemic T-cell immunity. In addition, mucosal anti-Spike IgG and IgA, lung resident B cells, and effector memory and resident T cells were efficiently induced, correlating with complete pulmonary protection against the SARS-CoV-2 Delta variant, demonstrating the suitability of the LV::S Beta-2P vaccine candidate as an intranasal booster against COVID-19.