Abstract New affordable therapeutic protocols for COVID-19 are urgently needed despite the increasing number of effective vaccines and monoclonal antibodies. To this end, there is increasing attention towards computational methods for drug repositioning and de novo drug design. Here, we systematically integrated multiple data-driven computational approaches to perform virtual screening and prioritize candidate drugs for the treatment of COVID-19. From the set of prioritized drugs, we selected a subset of representative candidates to test in human cells. Two compounds, 7-hydroxystaurosporine and bafetinib, showed synergistic antiviral effects in our in vitro experiments, and strongly inhibited viral-induced syncytia formation. Moreover, since existing drug repositioning methods provide limited usable information for de novo drug design, we extracted and prioritized the chemical substructures of the identified drugs, providing a chemical vocabulary that may help to design new effective drugs.

Herein we report the design and the synthesis of a library of new and more hydrophilic bisindole analogues based on our previously identified antileishmanial compound URB1483 that failed the preliminary in vivo test. The novel bisindoles were phenotypically screened for efficacy against Leishmania infantum promastigotes and simultaneously for toxicity on human macrophage-like THP-1 cells. Among the less toxic compounds, eight bisindoles showed IC50 below 10 μM. The most selective compound 1h (selectivity index = 10.1, comparable to miltefosine) and the most potent compound 2c (IC50 = 2.7 μM) were tested for their efficacy on L. infantum intracellular amastigotes. The compounds also demonstrated their efficacy in the in vitro infection model, showing IC50 of 11.1 and 6.8 μM for 1h and 2c, respectively. Moreover, 1h showed a better toxicity profile than the commercial drug miltefosine. For all these reasons, 1h could be a possible new starting point for hydrophilic antileishmanial agents with low cytotoxicity on human macrophage-like cells.

Membrane-bound pyrophosphatases are homodimeric integral membrane proteins that hydrolyse pyrophosphate into orthophosphates, coupled to the active transport of protons or sodium ions across membranes. They are important in the life cycle of bacteria, archaea, plants, and protist parasites, but no homologous proteins exist in vertebrates, making them a promising drug target. Here, we report the first non-phosphorous allosteric inhibitor (Ki of 1.8 ± 0.3 μM) of the thermophilic bacterium Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase and its bound structure at 3.7 Å resolution together with the substrate analogue imidodiphosphate. The unit cell contains two protein homodimers, each binding a single inhibitor dimer near the exit channel, creating a hydrophobic clamp that inhibits the movement of β-strand 1–2 during pumping, and thus preventing the hydrophobic gate from opening. This asymmetry of inhibitor binding with respect to each homodimer provide the first clear demonstration of asymmetry in the catalytic cycle of membrane-bound pyrophosphatases.

Electroconvulsive therapy (ECT) remains among the most efficient antidepressants but it seldom brings immediate remedy. However, a subanesthetic dose of NMDA-R (N-methyl-D-aspartate receptor) blocker ketamine ameliorates symptoms of depression already within hours. Glutamatergic excitability and regulation of TrkB neurotrophin receptor and GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) signaling are considered as molecular-level determinants for ketamine's antidepressant effects. Recent clinical observations suggests that nitrous oxide (N2O, "laughing gas"), another NMDA-R blocking dissociative anesthestic, also produces rapid antidepressant effects but the underlying mechanisms remain essentially unstudied. In this animal study we show that N2O, with a clinically relevant dosing regimen, evokes an emergence of rebound slow EEG (electroencephalogram) oscillations, a phenomenon considered to predict the efficacy and onset-of-action ECT. Very similar rebound slow oscillations are induced by subanesthetic ketamine and flurothyl (a treatment analogous to ECT). These responses become best evident upon drug withdrawal, i.e. after the peak of acute pharmacological actions, when their most prominent effects on cortical excitability have subsided. Most importantly, TrkB and GSK3β signaling remain unchanged during N2O administration (ongoing NMDA-R blockade) but emerge gradually upon gas withdrawal along with increased slow EEG oscillations. Collectively these findings reveal that rapid-acting antidepressants produce cortical excitability that triggers "a brain state" dominated by ongoing slow oscillations, sedation and drowsiness during which TrkB and GSK3β signaling alterations are induced.

Abstract Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are homodimeric proteins that hydrolyse pyrophosphate and pump H + /Na + across membranes. They are crucial for the virulence of protist pathogens, making them attractive drug targets. In this study, we investigate the inhibitory effects of seven distinct bisphosphonates against Thermotoga maritima mPPase to explore their mode of action and assist in future small molecule inhibitor development. We solved two structures of mPPase bound to the inhibitors in the enzyme active sites and probed the conformational dynamics of mPPase under multiple inhibitors and functionally relevant conditions by double electron-electron resonance (DEER) spectroscopy. We found that mPPase adopts five distinct conformations within the ensemble in the presence of different inhibitors. Combined with solid-supported membrane-based electrophysiology recordings, this revealed that during catalysis, one monomer of the dimer remains open, and Na + can only be pumped in a closed state. These results further support the existence of catalytic asymmetry in our pumping-before-hydrolysis model.

ABSTRACT The complex cell wall and biofilm matrix (ECM) act as key barriers to antibiotics in mycobacteria. Here, the ECM-proteins of Mycobacterium marinum ATCC927, a non-tuberculous mycobacterial model, was monitored over three months by label-free proteomics and compared with cell-surface proteins on planktonic cells to uncover pathways leading to virulence, tolerance, and persistence. We show that ATCC927 forms pellicle-type (PBFs) and submerged-type (SBFs) biofilms after two weeks and two days of growth, respectively, and that the increased CelA1 synthesis in this strain prevents biofilm formation and leads to reduced rifampicin tolerance. The proteomic data suggests that specific changes in mycolic acid synthesis (cord factor), Esx1-secretion, and cell-wall adhesins explain the appearance of PBFs as ribbon-like cords and SBFs as lichen-like structures. A subpopulation of cells resisting the 64 × MIC rifampicin (persisters) were detected in both biofilm subtypes, and already in one-week-old SBFs. The key forces boosting their development could include subtype-dependent changes in asymmetric cell division, cell wall biogenesis, tricarboxylic acid/glyoxylate cycle activities, and energy/redox/iron metabolisms. The effect of varying ambient oxygen tensions on each cell type and non-classical protein secretion are likely factors explaining majority of the subtype-specific changes. The proteomic findings also imply that Esx1-type protein secretion is more efficient in PL and PBF cells, while SBF may prefer both the Esx5- and non-classical pathways to control virulence and prolonged viability/persistence. In conclusion, this study reports a first proteomic insight into aging mycobacterial biofilm-ECMs and indicates biofilm subtype-dependent mechanisms conferring increased adaptive potential and virulence on non-tuberculous mycobacteria. IMPORTANCE Mycobacteria are naturally resilient and mycobacterial infections are notoriously difficult to treat with antibiotics, with biofilm formation being the main factor complicating the successful treatment of TB. The present study shows that non-tuberculous Mycobacterium marinum ATCC927 forms submerged- and pellicle-type biofilms with lichen- and ribbon-like structures, respectively, as well as persister cells under the same conditions. We show that both biofilm subtypes differ in terms of virulence-, tolerance- and persistence-conferring activities, highlighting the fact that both subtypes should be targeted to maximize the power of antimycobacterial treatment therapies.