Cardiac macrophages are crucial for tissue repair after cardiac injury but are not well characterized. Here we identify four populations of cardiac macrophages. At steady state, resident macrophages were primarily maintained through local proliferation. However, after macrophage depletion or during cardiac inflammation, Ly6chi monocytes contributed to all four macrophage populations, whereas resident macrophages also expanded numerically through proliferation. Genetic fate mapping revealed that yolk-sac and fetal monocyte progenitors gave rise to the majority of cardiac macrophages, and the heart was among a minority of organs in which substantial numbers of yolk-sac macrophages persisted in adulthood. CCR2 expression and dependence distinguished cardiac macrophages of adult monocyte versus embryonic origin. Transcriptional and functional data revealed that monocyte-derived macrophages coordinate cardiac inflammation, while playing redundant but lesser roles in antigen sampling and efferocytosis. These data highlight the presence of multiple cardiac macrophage subsets, with different functions, origins, and strategies to regulate compartment size.

Caveolin-1 is the principal structural protein of caveolae membranes in fibroblasts and endothelia. Recently, we have shown that the human CAV-1 gene is localized to a suspected tumor suppressor locus, and mutations in Cav-1 have been implicated in human cancer. Here, we created a caveolin-1 null (CAV-1 −/−) mouse model, using standard homologous recombination techniques, to assess the role of caveolin-1 in caveolae biogenesis, endocytosis, cell proliferation, and endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) signaling. Surprisingly, Cav-1 null mice are viable. We show that these mice lack caveolin-1 protein expression and plasmalemmal caveolae. In addition, analysis of cultured fibroblasts from Cav-1 null embryos reveals the following: (i) a loss of caveolin-2 protein expression; (ii) defects in the endocytosis of a known caveolar ligand, i.e.fluorescein isothiocyanate-albumin; and (iii) a hyperproliferative phenotype. Importantly, these phenotypic changes are reversed by recombinant expression of the caveolin-1 cDNA. Furthermore, examination of the lung parenchyma (an endothelial-rich tissue) shows hypercellularity with thickened alveolar septa and an increase in the number of vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1)-positive endothelial cells. As predicted, endothelial cells from Cav-1 null mice lack caveolae membranes. Finally, we examined eNOS signaling by measuring the physiological response of aortic rings to various stimuli. Our results indicate that eNOS activity is up-regulated in Cav-1 null animals, and this activity can be blunted by using a specific NOS inhibitor, nitro-l-arginine methyl ester. These findings are in accordance with previous in vitro studies showing that caveolin-1 is an endogenous inhibitor of eNOS. Thus, caveolin-1 expression is required to stabilize the caveolin-2 protein product, to mediate the caveolar endocytosis of specific ligands, to negatively regulate the proliferation of certain cell types, and to provide tonic inhibition of eNOS activity in endothelial cells. Caveolin-1 is the principal structural protein of caveolae membranes in fibroblasts and endothelia. Recently, we have shown that the human CAV-1 gene is localized to a suspected tumor suppressor locus, and mutations in Cav-1 have been implicated in human cancer. Here, we created a caveolin-1 null (CAV-1 −/−) mouse model, using standard homologous recombination techniques, to assess the role of caveolin-1 in caveolae biogenesis, endocytosis, cell proliferation, and endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) signaling. Surprisingly, Cav-1 null mice are viable. We show that these mice lack caveolin-1 protein expression and plasmalemmal caveolae. In addition, analysis of cultured fibroblasts from Cav-1 null embryos reveals the following: (i) a loss of caveolin-2 protein expression; (ii) defects in the endocytosis of a known caveolar ligand, i.e.fluorescein isothiocyanate-albumin; and (iii) a hyperproliferative phenotype. Importantly, these phenotypic changes are reversed by recombinant expression of the caveolin-1 cDNA. Furthermore, examination of the lung parenchyma (an endothelial-rich tissue) shows hypercellularity with thickened alveolar septa and an increase in the number of vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1)-positive endothelial cells. As predicted, endothelial cells from Cav-1 null mice lack caveolae membranes. Finally, we examined eNOS signaling by measuring the physiological response of aortic rings to various stimuli. Our results indicate that eNOS activity is up-regulated in Cav-1 null animals, and this activity can be blunted by using a specific NOS inhibitor, nitro-l-arginine methyl ester. These findings are in accordance with previous in vitro studies showing that caveolin-1 is an endogenous inhibitor of eNOS. Thus, caveolin-1 expression is required to stabilize the caveolin-2 protein product, to mediate the caveolar endocytosis of specific ligands, to negatively regulate the proliferation of certain cell types, and to provide tonic inhibition of eNOS activity in endothelial cells. caveolin-1 caveolin-2 caveolin-3 endothelial nitric-oxide synthase fluorescein isothiocyanate nitro-l-arginine methyl ester mitogen-activated protein epidermal growth factor EGF receptor vascular endothelial growth factor receptor monoclonal antibody kilobase pair base pair polymerase chain reaction mouse embryonic fibroblast polyacrylamide gel electrophoresis green fluorescent protein phosphate-buffered saline bovine serum albumin Dulbecco's modified Eagle's medium fetal bovine serum plaque-forming units knockout nitric oxide nitric-oxide synthase phenylephrine acetylcholine polyclonal antibody 4-morpholine-ethanesulfonic acid embryonic stem caveolin-1 scaffolding domain Caveolin was first identified in 1989 by Glenney and colleagues (1Glenney Jr., J.R. J. Biol. Chem. 1989; 264: 20163-20166Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 2Glenney Jr., J.R. Zokas L. J. Cell Biol. 1989; 108: 2401-2408Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) as a major v-Src substrate in Rous sarcoma virus-transformed chicken embryo fibroblasts. Interestingly, this same protein was found to be the primary structural component of caveolae microdomains, 50–100 nm vesicular invaginations of the plasma membrane (3Rothberg K.G. Heuser J.E. Donzell W.C. Ying Y.S. Glenney J.R. Anderson R.G. Cell. 1992; 68: 673-682Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1910) Google Scholar). Caveolae were morphologically described as early as the 1950s by Yamada (4Yamada E. J. Biophys. Biochem. Cytol. 1955; 1: 445-458Crossref PubMed Scopus (541) Google Scholar) and Palade (5Farquhar M. Palade G. J. Cell Biol. 1963; 17: 375-412Crossref PubMed Scopus (2209) Google Scholar). They are curious structures that can be found individually or in clusters at the surfaces of numerous cell types, the best examples of which are adipocytes, endothelial cells, muscle cells, and fibroblasts. Research in the past decade has shown that caveolae are specialized membrane microdomains formed as a result of localized accumulation of cholesterol, glycosphingolipids, and caveolin (6Fra A.M. Williamson E. Simons K. Parton R.G. Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 1995; 92: 8655-8659Crossref PubMed Scopus (532) Google Scholar, 7Li S. Song K.S. Koh S.S. Kikuchi A. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 28647-28654Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (127) Google Scholar, 8Murata M. Peranen J. Schreiner R. Weiland F. Kurzchalia T. Simons K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 10339-10343Crossref PubMed Scopus (781) Google Scholar). Caveolin, an integral membrane protein that can directly bind cholesterol, most likely plays a major role in the invagination of caveolae from the plasma membrane proper, although our understanding of the mechanisms behind this process remains rudimentary. Two other members of the caveolin gene family have recently been identified and cloned, caveolin-2 and caveolin-3 (9Scherer P.E. Okamoto T. Chun M. Nishimoto I. Lodish H.F. Lisanti M.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 131-135Crossref PubMed Scopus (501) Google Scholar, 10Song K.S. Scherer P.E. Tang Z.-L. Okamoto T. Li S. Chafel M. Chu C. Kohtz D.S. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15160-15165Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (621) Google Scholar); as a consequence, caveolin has been re-termed caveolin-1 (Cav-1).1 Caveolin-2 has the same tissue distribution as and co-localizes with caveolin-1, whereas caveolin-3 is expressed only in cardiac, skeletal, and smooth muscle cells (11Scherer P.E. Lewis R.Y. Volonte D. Engelman J.A. Galbiati F. Couet J. Kohtz D.S. van Donselaar E. Peters P. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1997; 272: 29337-29346Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (479) Google Scholar, 12Tang Z.-L. Scherer P.E. Okamoto T. Song K. Chu C. Kohtz D.S. Nishimoto I. Lodish H.F. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 2255-2261Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (616) Google Scholar). Although caveolae function in vesicular and cholesterol trafficking (13Galbiati F. Razani B. Lisanti M.P. Cell. 2001; 106: 403-411Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (519) Google Scholar, 14Razani B. Schlegel A. Lisanti M.P. J. Cell Sci. 2000; 113: 2103-2109Crossref PubMed Google Scholar), they have also been implicated in signal transduction at the plasma membrane (15Couet J. Li S. Okamoto T. Scherer P.S. Lisanti M.P. Trends Cardiovasc. Med. 1997; 7: 103-110Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar, 16Lisanti M.P. Scherer P. Tang Z.-L. Sargiacomo M. Trends Cell Biol. 1994; 4: 231-235Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (597) Google Scholar). Biochemical and morphological experiments have shown that a variety of lipid-modified signaling molecules are concentrated within these plasma membrane microdomains, such as Src family tyrosine kinases, Ha-Ras, eNOS, and heterotrimeric G-proteins (17Li S. Couet J. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 29182-29190Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (681) Google Scholar, 18Song K.S. Li S. Okamoto T. Quilliam L. Sargiacomo M. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 9690-9697Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (924) Google Scholar, 19Song K.S. Sargiacomo M. Galbiati F. Parenti M. Lisanti M.P. Cell. Mol. Biol. 1997; 43: 293-303PubMed Google Scholar, 20Garcia-Cardena G. Oh P. Liu J. Schnitzer J.E. Sessa W.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 6448-6453Crossref PubMed Scopus (583) Google Scholar, 21Shaul P.W. Smart E.J. Robinson L.J. German Z. Yuhanna I.S. Ying Y. Anderson R.G.W. Michel T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 6518-6522Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (627) Google Scholar, 22Li S. Okamoto T. Chun M. Sargiacomo M. Casanova J.E. Hansen S.H. Nishimoto I. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1995; 270: 15693-15701Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (559) Google Scholar). In many ways, caveolin-1 is intricately involved in caveolar functioning. In the years after the discovery that caveolae might serve to compartmentalize signaling molecules and facilitate cross-talk among signaling cascades (the so-called “caveolae signaling hypothesis” (16Lisanti M.P. Scherer P. Tang Z.-L. Sargiacomo M. Trends Cell Biol. 1994; 4: 231-235Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (597) Google Scholar)), Cav-1 has been found to be a key regulator of some of these proteins. Both in vitro and cell culture experiments indicate that Cav-1 can directly interact with and maintain some of these signaling molecules in an inactive conformation (reviewed in Ref.23Okamoto T. Schlegel A. Scherer P.E. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1998; 273: 5419-5422Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1361) Google Scholar). In effect, Cav-1 seems to act as a scaffolding protein, able to negatively regulate the activity of other molecules by binding to and releasing them in a timely fashion. Research in the past few years has established a recurring theme in this regulation. Many of the proteins that either interact with, transcriptionally repress, or are inhibited by Cav-1 fall under the pro-proliferative, oncogenic, and anti-apoptotic category of molecules. Cav-1 interacts with and negatively regulates the EGF-R, platelet-derived growth factor receptor, and Neu tyrosine kinases (24Couet J. Sargiacomo M. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30429-30438Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (554) Google Scholar, 25Yamamoto M. Toya Y. Jensen R.A. Ishikawa Y. Exp. Cell Res. 1999; 247: 380-388Crossref PubMed Scopus (102) Google Scholar, 26Engelman J.A. Lee R.J. Karnezis A. Bearss D.J. Webster M. Siegel P. Muller W.J. Windle J.J. Pestell R.G. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1998; 273: 20448-20455Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (191) Google Scholar), Ha-Ras (17Li S. Couet J. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 29182-29190Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (681) Google Scholar, 18Song K.S. Li S. Okamoto T. Quilliam L. Sargiacomo M. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 9690-9697Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (924) Google Scholar), c-Src (17Li S. Couet J. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 29182-29190Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (681) Google Scholar), and phosphatidylinositol 3-kinase (27Zundel W. Swiersz L.M. Giaccia A. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 1507-1514Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar). Conversely, caveolin-1 levels are transcriptionally reduced upon activation of the oncogenes Ha-ras, v-abl, myc, neu, the HPV oncogeneE6, among others (26Engelman J.A. Lee R.J. Karnezis A. Bearss D.J. Webster M. Siegel P. Muller W.J. Windle J.J. Pestell R.G. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1998; 273: 20448-20455Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (191) Google Scholar, 28Koleske A.J. Baltimore D. Lisanti M.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 1381-1385Crossref PubMed Scopus (475) Google Scholar, 29Razani B. Altschuler Y. Zhu L. Pestell R.G. Mostov K.E. Lisanti M.P. Biochemistry. 2000; 39: 13916-13924Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 30Park D.S. Razani B. Lasorella A. Schreiber-Agus N. Pestell R.G. Iavarone A. Lisanti M.P. Biochemistry. 2001; 40: 3354-3362Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). Therefore, it is not surprising that we and others (26Engelman J.A. Lee R.J. Karnezis A. Bearss D.J. Webster M. Siegel P. Muller W.J. Windle J.J. Pestell R.G. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1998; 273: 20448-20455Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (191) Google Scholar, 29Razani B. Altschuler Y. Zhu L. Pestell R.G. Mostov K.E. Lisanti M.P. Biochemistry. 2000; 39: 13916-13924Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 31Lee S.W. Reimer C.L. Oh P. Campbel L.D.B. Schnitzer J.E. Oncogene. 1998; 16: 1391-1397Crossref PubMed Scopus (401) Google Scholar, 32Bender F.C. Reymond M.A. Bron C. Quest A. Cancer Res. 2000; 60: 5870-5878PubMed Google Scholar, 33Bagnoli M. Tomassetti A. Figini M. Flati S. Dolo V. Canevari S. Miotti S. Oncogene. 2000; 19: 4754-4763Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar, 34Zhang W. Razani B. Altschuler Y. Bouzahzah B. Mostov K.E. Pestell R.G. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 2000; 275: 20717-20725Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (126) Google Scholar, 35Engelman J.A. Zhang X.L. Lisanti M.P. FEBS Lett. 1999; 448: 221-230Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar, 36Racine C. Belanger M. Hirabayashi H. Boucher M. Chakir J. Couet J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 255: 580-586Crossref PubMed Scopus (154) Google Scholar, 37Suzuki T. Suzuki Y. Hanada K. Hashimoto A. Redpath J.L. Stanbridge E.J. Nishijima M. Kitagawa T. J. Biochem. (Tokyo). 1998; 124: 383-388Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar) observed undetectable or very low expression levels of Cav-1 in numerous tumor-derived cell lines. For some time, it has been known that a certain locus (D7S522; 7q31.1) is an aphidicolin-induced fragile site in the human genome (38Shridhar V. Sun Q.C. Miller O.J. Kalemkerian G.P. Petros J. Smith D.I. Oncogene. 1997; 15: 2727-2733Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar, 39Jenkins R.B. Qian J. Lee H.K. Huang H. Hirasawa K. Bostwick D.G. Proffitt J. Wilber K. Lieber M.M. Liu W. Smith D.I. Cancer Res. 1998; 58: 759-766PubMed Google Scholar) and a hot spot for deletions in a variety of human tumors including breast, prostate, colorectal, ovarian, pancreatic, and renal cell carcinomas (38Shridhar V. Sun Q.C. Miller O.J. Kalemkerian G.P. Petros J. Smith D.I. Oncogene. 1997; 15: 2727-2733Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar, 40Zenklusen J.C. Thompson J.C. Troncoso P. Kagan J. Conti C.J. Cancer Res. 1994; 54: 6370-6373PubMed Google Scholar, 41Zenklusen J.C. Bieche I. Lidereau R. Conti C.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 12155-12158Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar, 42Huang H. Qian C. Jenkins R.B. Smith D.I. Genes Chromosomes Cancer. 1998; 21: 152-159Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 43Zenklusen J.C. Thompson J.C. Klein-Szanto A.J. Conti C.J. Cancer Res. 1995; 55: 1347-1350PubMed Google Scholar, 44Zenklusen J.C. Weitzel J.N. Ball H.G. Conti C.J. Oncogene. 1995; 11: 359-363PubMed Google Scholar, 45Koike M. Takeuchi S. Yokota J. Park S. Hatta Y. Miller C.W. Tsuruoka N. Koeffler H.P. Genes Chromosomes Cancer. 1997; 19: 1-5Crossref PubMed Scopus (57) Google Scholar, 46Achille A. Biasi M.O. Zamboni G. Bogina G. Magalini A.R. Pederzoli P. Perucho M. Scarpa A. Cancer Res. 1996; 56: 3808-3813PubMed Google Scholar). Interestingly, determination of the genomic organization of the human CAV-1 locus revealed that it maps to 7q31.1, adjacent to the LOH marker D7S522, and as of yet it still remains the closest known gene to this putative tumor suppressor locus (35Engelman J.A. Zhang X.L. Lisanti M.P. FEBS Lett. 1999; 448: 221-230Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar, 47Engelman J.A. Zhang X.L. Galbiati F. Volonte D. Sotgia F. Pestell R.G. Minetti C. Scherer P.E. Okamoto T. Lisanti M.P. Am. J. Hum. Genet. 1998; 63: 1578-1587Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar). Taken together, the results described above have led many investigators to propose the possibility that Cav-1 is indeed a “tumor suppressor” whose reduction/deletion in cells would provide growth advantages and expedite tumorigenesis. In support of this idea, the only two methods thus far used to abolish Cav-1 expression have arrived at similar conclusions. Antisense-mediated down-regulation of Cav-1 in NIH-3T3 fibroblasts leads to a hyperactivation of the p42/44 MAP kinase pathway and anchorage-independent growth (48Galbiati F. Volonté D. Engelman J.A. Watanabe G. Burk R. Pestell R. Lisanti M.P. EMBO J. 1998; 17: 6633-6648Crossref PubMed Scopus (435) Google Scholar). An RNA interference-based ablation of Cav-1 in Caenorhabditis elegans leads to progression of the meiotic cell cycle, a phenotype that mirrors that of Ras activation (49Scheel J. Srinivasan J. Honnert U. Henske A. Kurzchalia T.V. Nat. Cell Biol. 1999; 1: 127-129Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar). Furthermore, a recent report indicates that the caveolin-1 gene is mutated in up to 16% of human breast cancer samples examined (50Hayashi K. Matsuda S. Machida K. Yamamoto T. Fukuda Y. Nimura Y. Hayakawa T. Hamaguchi M. Cancer Res. 2001; 61: 2361-2364PubMed Google Scholar). Recombinant expression of the caveolin-1 cDNA harboring this mutation (P132L) was sufficient to transform NIH 3T3 cells (50Hayashi K. Matsuda S. Machida K. Yamamoto T. Fukuda Y. Nimura Y. Hayakawa T. Hamaguchi M. Cancer Res. 2001; 61: 2361-2364PubMed Google Scholar). As similar results have been obtained previously using an antisense approach to ablate caveolin-1 expression (48Galbiati F. Volonté D. Engelman J.A. Watanabe G. Burk R. Pestell R. Lisanti M.P. EMBO J. 1998; 17: 6633-6648Crossref PubMed Scopus (435) Google Scholar), these results indicate that the caveolin-1 (P132L) mutation may behave in a dominant-negative fashion. Interestingly, an analogous mutation occurs within the caveolin-3 gene (P104L) in patients with a novel form of autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy (LGMD-1C) (51Minetti C. Sotgia F. Bruno C. Scartezzini P. Broda P. Bado M. Masetti E. Mazzocco P. Egeo A. Donati M.A. Volonte' D. Galbiati F. Cordone G. Bricarelli F.D. Lisanti M.P. Zara F. Nat. Genet. 1998; 18: 365-368Crossref PubMed Scopus (504) Google Scholar). In order to gain a better understanding of caveolae and caveolin-1 functioning in a mammalian organism, we used a gene targeting strategy to disrupt the Cav-1 locus in the mouse. In this way, we could observe the role Cav-1 plays in animal physiology (i.e. during development and into adult life) as well as molecularly (i.e. caveolar biogenesis, its interaction with caveolin-2, and its functional roles in endocytosis, cellular proliferation, and signal transduction). In this study, we describe the generation of mice lacking the cav-1 gene and determine some of the molecular side effects that result from a deficiency of Cav-1 expression. Undoubtedly, the generation of viable/fertile Cav-1-deficient mice (and cells derived from these animals) will allow us and others to critically evaluate the many proposed functions of caveolae organelles and the caveolin-1 protein in vivo. Antibodies and their sources were as follows: anti-caveolin-1 mAb 2297, anti-caveolin-2 mAb 65, and anti-caveolin-3 mAb 26 (10, 11, 52) (gifts of Dr. Roberto Campos-Gonzalez, BD Transduction Laboratories, Inc.); anti-caveolin-1 pAb N-20 (Santa Cruz Biotechnology); anti-p42/44 pAb and phospho-specific anti-p42/44 pAb (New England Biolabs); anti-β-tubulin mAb TUB-2.1 and anti-β-actin mAb AC-15 (Sigma). A variety of other reagents were purchased commercially as follows: cell culture reagents and the LipofectAMINE liposomal transfection reagent were from Life Technologies, Inc. Genomic clones containing the murine Cav-1 locus were isolated from a 129/Sv(J1) λ-phage genomic library (53Wu H. Liu X. Jaenisch R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 2819-2823Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar, 54Wu H. Liu X. Jaenisch R. Lodish H.F. Cell. 1995; 83: 59-67Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (870) Google Scholar) by using probes corresponding to the murine Cav-1 cDNA. The genomic organization of the locus was determined by subcloning portions of these genomic inserts into the vector pBS-SK+ (Stratagene) and using Southern blotting to determine a detailed restriction map of the region (55Engelman J.A. Zhang X.L. Galbiati F. Lisanti M.P. FEBS Lett. 1998; 429: 330-336Crossref PubMed Scopus (135) Google Scholar). One of the genomic clones (containing the first and second exons of Cav-1) was used to construct the targeting vector. Briefly, a 2.7-kbNotI-EcoRI fragment that is immediately 5′ to the first exon and a 2.1-kb BamHI-BamHI fragment that is immediately 3′ to the second exon of the cav-1 gene were used to flank the NEO cassette in the targeting vector pGT-N29 (New England Biolabs) (as shown in Fig. 1). WW6 ES cells (gift of Dr. Pamela Stanley (56Ioffe E. Liu Y. Bhaumik M. Poirier F. Factor S.M. Stanley P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 7357-7361Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar)) were electroporated with the linearized targeting construct (40 μg) and selected with G418 (150 μg/ml of active component, Life Technologies, Inc.) as described previously (57Edelmann W. Yang K. Umar A. Heyer J. Lau K. Fan K. Liedtke W. Cohen P.E. Kane M.F. Lipford J.R. Yu N. Crouse G.F. Pollard J.W. Kunkel T. Lipkin M. Kolodner R. Kucherlapati R. Cell. 1997; 91: 467-477Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). Homologous recombination in 360 selected ES clones was assessed via Southern blot analysis. Briefly, genomic DNA was digested with PstI orXbaI and hybridized with a 1.1-kbXbaI-SacI probe; Cav-1+/− clones produced an 8.0-kb wild-type and a 5.5-kb knockout band (PstI digest) or a 10.0-kb wild-type and a 4.0-kb knockout band (XbaI digest) (as shown in Fig. 1). Four Cav-1+/− ES clones were microinjected into C57BL/6 blastocysts, and three gave rise to male chimeras with a significant ES cell contribution (as determined by an Agouti coat color). By mating with C57BL/6 females and genotyping of offspring tail DNA via Southern and PCR analysis, germ line transmission was confirmed for two separate clones (Fig. 1). F1 male and female heterozygous animals were interbred to obtain Cav-1-deficient animals. To facilitate the genotyping of all future mice, we also devised a 3-primer PCR-based screening strategy. The wild-type specific forward primer was derived from Cav-1 exon 2 (5′-GTGTATGACGCGCACACCAAG-3′); the knockout-specific forward primer was derived from the neomycin cassette (5′-CTAGTGAGACGTGCTACTTCC-3′), and the common reverse primer was derived from Cav-1 intron 2 (5′-CTTGAGTTCTGTTAGCCCAG-3′). PCR conditions were 95 °C/5 min, 35 cycles of (95 °C/1 min, 56 °C/1 min, 72 °C/1 min 20 s) and then 72 °C/7 min, which resulted in a ∼650-bp wild-type band and a ∼330-bp knockout band. Animals were analyzed at 2–4.5 months of age. Experiments were conducted under the direct supervision of the trained veterinarians of the Einstein Animal Institute, and animal protocols were approved by the Animal Use Committee. Primary MEFs were obtained from Day 13.5 embryos essentially as described (58Kamijo T. Zindy F. Roussel M.F. Quelle D.E. Downing J.R. Ashmun R.A. Grosveld G. Sherr C.J. Cell. 1997; 91: 649-659Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1396) Google Scholar). Briefly, embryos were decapitated, thoroughly minced, and trypsinized in 1 ml of 0.05% trypsin, 0.53 mm EDTA (Life Technologies, Inc.) for 20 min at 37 °C. Ten ml of complete medium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mmglutamine, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin (Life Technologies, Inc.)) was used to inactivate the trypsin and resuspend the dissociated cells. Cells were plated on a 10-cm plate and cultured in a 37 °C, 5% CO2 incubator. These “passage 1” cells were further propagated using a defined 3T3 passaging protocol (i.e. 3 × 105 cells were plated per 60-mm dish every 3 days). For all experiments early passage primary MEFs (<5) were used. To immortalize MEFs, cells were passaged according to the 3T3 protocol continuously until growth rates in culture resumed the rapid rates seen in early passage MEFs (i.e. Passage 25 cells and beyond). MEFs were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 m cacodylate buffer post-fixed with OsO4, and stained with uranyl acetate and lead citrate. A cryotome was used to yield sections, and the samples were examined under a JEOL 1200EX transmission electron microscope and photographed at a magnification of × 16,000 (59Sargiacomo M. Sudol M. Tang Z.-L. Lisanti M.P. J. Cell Biol. 1993; 122: 789-807Crossref PubMed Scopus (879) Google Scholar, 60Lisanti M.P. Scherer P.E. Vidugiriene J. Tang Z.-L. Hermanoski-Vosatka A. Tu Y.-H. Cook R.F. Sargiacomo M. J. Cell Biol. 1994; 126: 111-126Crossref PubMed Scopus (826) Google Scholar, 61Engelman J.A. Wycoff C.C. Yasuhara S. Song K.S. Okamoto T. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1997; 272: 16374-16381Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). Caveolae were identified by their characteristic flask shape, size (50–100 nm), and location at or near the plasma membrane (28Koleske A.J. Baltimore D. Lisanti M.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 1381-1385Crossref PubMed Scopus (475) Google Scholar). The cDNA encoding full-length caveolin-1 was subcloned into pCB7, a mammalian expression vector driven by the cytomegalovirus promoter (62Song K.S. Tang Z.-L. Li S. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1997; 272: 4398-4403Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar). The cDNAs encoding GFP and GFP-Cav-1 (containing the full-length Cav-1 cDNA C-terminal to GFP) were as described previously (63Volonte D. Galbiati F. Lisanti M.P. FEBS Lett. 1999; 445: 431-439Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar). Cells were cultured in their respective media and allowed to reach 80–90% confluency. Subsequently, they were washed with PBS and incubated with lysis buffer (10 mmTris, pH 7.5; 50 mm NaCl; 1% Triton X-100; 60 mm octyl glucoside) containing protease inhibitors (Roche Molecular Biochemicals). Protein concentrations were quantified using the BCA reagent (Pierce), and the volume required for 10 μg of protein was determined. Samples were separated by SDS-PAGE (12.5% acrylamide) and transferred to nitrocellulose. The nitrocellulose membranes were stained with Ponceau S (to visualize protein bands) followed by immunoblot analysis. All subsequent wash buffers contained 10 mm Tris, pH 8.0, 150 mm NaCl, 0.05% Tween 20, which was supplemented with 1% bovine serum albumin (BSA) and 2% nonfat dry milk (Carnation) for the blocking solution and 1% BSA for the antibody diluent. Primary antibodies were used at a 1:500 dilution. Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (1:5000 dilution, Pierce) were used to visualize bound primary antibodies with the Supersignal chemiluminescence substrate (Pierce). Caveolae-enriched membrane fractions were purified essentially as we described previously (59Sargiacomo M. Sudol M. Tang Z.-L. Lisanti M.P. J. Cell Biol. 1993; 122: 789-807Crossref PubMed Scopus (879) Google Scholar). 200 mg of lung tissue was placed in 2 ml of MBS (25 mm Mes, pH 6.5, 150 mm NaCl) containing 1% Triton X-100 and solubilized by using quick 10-s bursts of a rotor homogenizer and passing 10 times through a loose fitting Dounce homogenizer. The sample was mixed with an equal volume of 80% sucrose (prepared in MBS lacking Triton X-100), transferred to a 12-ml ultracentrifuge tube, and overlaid with a discontinuous sucrose gradient (4 ml of 30% sucrose, 4 ml of 5% sucrose, both prepared in MBS, lacking detergent). The samples were subjected to centrifugation at 200,000 × g (39,000 rpm in a Sorval rotor TH-641) for 16 h. A light scattering band was observed at the 5–30% sucrose interface. Twelve 1-ml fractions were collected, and 50-μl aliquots of each fraction were subjected to SDS-PAGE and immunoblotting. The procedure was performed as we described previously (17Li S. Couet J. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 29182-29190Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (681) Google Scholar). MEFs (either un-transfected or transfected with the caveolin-1 cDNA) were fixed for 30 min in PBS containing 2% paraformaldehyde, rinsed with PBS, and quenched with 50 mm NH4Cl for 10 min. The cells were then incubated in permeabilization buffer (PBS; 0.2% BSA; 0.1% Triton X-100) for 10 min, washed with PBS, and double-labeled with a 1:400 dilution of anti-caveolin-1 pAb N-20 and 1:200 dilution of anti-caveolin-2 mAb for 60 min. After rinsing with PBS (3 times), secondary antibodies (7.5 μg/ml) ((lissamine-rhodamine-conjugated goat anti-rabbit and fluorescein (FITC)-conjugated goat anti-mouse) antibodies (Ja

Transforming growth factor-beta (TGF-beta) signaling proceeds from the cell membrane to the nucleus through the cooperation of the type I and II serine/threonine kinase receptors and their downstream SMAD effectors. Although various regulatory proteins affecting TGF-beta-mediated events have been described, relatively little is known about receptor interactions at the level of the plasma membrane. Caveolae are cholesterol-rich membrane microdomains that, along with their marker protein caveolin-1 (Cav-1), have been implicated in the compartmentalization and regulation of certain signaling events. Here, we demonstrate that specific components of the TGF-beta cascade are associated with caveolin-1 in caveolae and that Cav-1 interacts with the Type I TGF-beta receptor. Additionally, Cav-1 is able to suppress TGF-beta-mediated phosphorylation of Smad-2 and subsequent downstream events. We localize the Type I TGF-beta receptor interaction to the scaffolding domain of Cav-1 and show that it occurs in a physiologically relevant time frame, acting to rapidly dampen signaling initiated by the TGF-beta receptor complex.

Macrophages promote both injury and repair after myocardial infarction, but discriminating functions within mixed populations remains challenging. Here we used fate mapping, parabiosis and single-cell transcriptomics to demonstrate that at steady state, TIMD4+LYVE1+MHC-IIloCCR2- resident cardiac macrophages self-renew with negligible blood monocyte input. Monocytes partially replaced resident TIMD4-LYVE1-MHC-IIhiCCR2- macrophages and fully replaced TIMD4-LYVE1-MHC-IIhiCCR2+ macrophages, revealing a hierarchy of monocyte contribution to functionally distinct macrophage subsets. Ischemic injury reduced TIMD4+ and TIMD4- resident macrophage abundance, whereas CCR2+ monocyte-derived macrophages adopted multiple cell fates within infarcted tissue, including those nearly indistinguishable from resident macrophages. Recruited macrophages did not express TIMD4, highlighting the ability of TIMD4 to track a subset of resident macrophages in the absence of fate mapping. Despite this similarity, inducible depletion of resident macrophages using a Cx3cr1-based system led to impaired cardiac function and promoted adverse remodeling primarily within the peri-infarct zone, revealing a nonredundant, cardioprotective role of resident cardiac macrophages.

Caveolae organelles and caveolin-1 protein expression are most abundant in adipocytes and endothelial cells. Our initial report on mice lacking caveolin-1 (Cav-1) demonstrated a loss of caveolae and perturbations in endothelial cell function. More recently, however, observation of the Cav-1-deficient cohorts into old age revealed significantly lower body weights, as compared with wild-type controls. These results suggest that Cav-1 null mice may have problems with lipid metabolism and/or adipocyte functioning. To test this hypothesis directly, we placed a cohort of wild-type and Cav-1 null mice on a high fat diet. Interestingly, despite being hyperphagic, Cav-1 null mice show overt resistance to diet-induced obesity. As predicted, adipocytes from Cav-1 null null mice lack caveolae membranes. Early on, a lack of caveolin-1 selectively affects only the female mammary gland fat pad and results in a near complete ablation of the hypo-dermal fat layer. There are also indications of generalized adipose tissue pathology. With increasing age, a systemic decompensation in lipid accumulation occurs resulting in dramatically smaller fat pads, histologically reduced adipocyte cell diameter, and a poorly differentiated/hypercellular white adipose parenchyma. To gain mechanistic insights into this phenotype, we show that, although serum insulin, glucose, and cholesterol levels are entirely normal, Cav-1 null mice have severely elevated triglyceride and free fatty acid levels, especially in the post-prandial state. However, this build-up of triglyceride-rich chylomicrons/very low density lipoproteins is not due to perturbed lipoprotein lipase activity, a major culprit of isolated hypertriglyceridemia. The lean body phenotype and metabolic defects observed in Cav-1 null mice are consistent with the previously proposed functions of caveolin-1 and caveolae in adipocytes. Our results show for the first time a clear role for caveolins in systemic lipid homeostasis in vivo and place caveolin-1/caveolae as major factors in hyperlipidemias and obesity. Caveolae organelles and caveolin-1 protein expression are most abundant in adipocytes and endothelial cells. Our initial report on mice lacking caveolin-1 (Cav-1) demonstrated a loss of caveolae and perturbations in endothelial cell function. More recently, however, observation of the Cav-1-deficient cohorts into old age revealed significantly lower body weights, as compared with wild-type controls. These results suggest that Cav-1 null mice may have problems with lipid metabolism and/or adipocyte functioning. To test this hypothesis directly, we placed a cohort of wild-type and Cav-1 null mice on a high fat diet. Interestingly, despite being hyperphagic, Cav-1 null mice show overt resistance to diet-induced obesity. As predicted, adipocytes from Cav-1 null null mice lack caveolae membranes. Early on, a lack of caveolin-1 selectively affects only the female mammary gland fat pad and results in a near complete ablation of the hypo-dermal fat layer. There are also indications of generalized adipose tissue pathology. With increasing age, a systemic decompensation in lipid accumulation occurs resulting in dramatically smaller fat pads, histologically reduced adipocyte cell diameter, and a poorly differentiated/hypercellular white adipose parenchyma. To gain mechanistic insights into this phenotype, we show that, although serum insulin, glucose, and cholesterol levels are entirely normal, Cav-1 null mice have severely elevated triglyceride and free fatty acid levels, especially in the post-prandial state. However, this build-up of triglyceride-rich chylomicrons/very low density lipoproteins is not due to perturbed lipoprotein lipase activity, a major culprit of isolated hypertriglyceridemia. The lean body phenotype and metabolic defects observed in Cav-1 null mice are consistent with the previously proposed functions of caveolin-1 and caveolae in adipocytes. Our results show for the first time a clear role for caveolins in systemic lipid homeostasis in vivo and place caveolin-1/caveolae as major factors in hyperlipidemias and obesity. caveolin-1 monoclonal antibody magnetic resonance imaging radioimmunoassay white adipose tissue mammary gland 4/subcutaneous very low density lipoprotein lipoprotein lipase brown adipose tissue protein kinase A endoplasmic reticulum Uniform 50- to 100-nm invaginations of the plasma membrane called caveolae remain one of the most intriguing and enigmatic organelles in the cell. As early as the 1950s, at the incipience of ultrastructural cell biology, caveolae were readily observable and morphologically distinct organelles described on the surface of epithelial/endothelial cells (1Yamada E. J. Biophys. Biochem. Cytol. 1955; 1: 445-458Crossref PubMed Scopus (545) Google Scholar, 2Palade G.E. J. Appl. Phys. 1953; 24: 1424-1436Google Scholar). Although a profile of the tissue distribution of caveolae has never been reported, a compilation of various reports to date arrives at one main conclusion: two tissue types have an extremely high abundance of these structures in vivo, adipose tissue (due to the adipocytes) and lung tissue (due to endothelial cells and type I pneumocytes). Based purely on ultrastructural comparisons, the adipocyte seems to have higher concentrations of caveolae than any other cell. Indeed, electron micrographs of adipocytes dating back to 1963 show that caveolae account for ∼ 30% of the surface area of the adipocyte plasma membrane (3Napolitano L.M. J. Cell Biol. 1963; 18: 663-679Crossref PubMed Scopus (223) Google Scholar, 4Fan J.Y. Carpentier J.-L. van Obberghen E. Grunfeld C. Gorden P. Orci L. J. Cell Sci. 1983; 61: 219-230Crossref PubMed Google Scholar). Furthermore, in 3T3-L1 cells, a widely used model system for studying adipogenesis, the number of caveolae increases ∼10-fold during adipocyte differentiation as compared with the undifferentiated fibroblastic state (4Fan J.Y. Carpentier J.-L. van Obberghen E. Grunfeld C. Gorden P. Orci L. J. Cell Sci. 1983; 61: 219-230Crossref PubMed Google Scholar). An important advance in the study of caveolae was the discovery that caveolin-1 (Cav-1)1 is a marker protein for caveolae organelles and that Cav-1 plays an intricate role in caveolar functioning (5Rothberg K.G. Heuser J.E. Donzell W.C. Ying Y.S. Glenney J.R. Anderson R.G. Cell. 1992; 68: 673-682Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1944) Google Scholar). Research in the past decade has shown that caveolae are specialized membrane microdomains formed as a result of the localized accumulation of cholesterol, glycosphingolipids, and caveolin-1 (6Fra A.M. Williamson E. Simons K. Parton R.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 8655-8659Crossref PubMed Scopus (533) Google Scholar, 7Li S. Song K.S. Koh S.S. Kikuchi A. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 28647-28654Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (127) Google Scholar, 8Murata M. Peranen J. Schreiner R. Weiland F. Kurzchalia T. Simons K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 10339-10343Crossref PubMed Scopus (781) Google Scholar). Caveolin-1, an integral membrane protein that can directly bind cholesterol, most likely plays a major role in the invagination of caveolae from the plasma membrane proper, but the mechanisms underlying this process remain unknown. Although the function of caveolae and caveolins in vivoremains controversial, they have been implicated in endocytosis/transcytosis, cholesterol transport/efflux, regulation of signal transduction, and tumorigenesis (reviewed in Ref. 9Smart E.J. Graf G.A. McNiven M.A. Sessa W.C. Engelman J.A. Scherer P.E. Okamoto T. Lisanti M.P. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 7289-7304Crossref PubMed Scopus (929) Google Scholar). True to its description as a “marker of caveolae,” examination of caveolin-1 transcripts and protein levels in a panel of mouse tissues reveals that the two highest expressing tissues are adipose tissue and lung tissue (an endothelial-rich organ) (10Scherer P.E. Lisanti M.P. Baldini G. Sargiacomo M. Corley-Mastick C. Lodish H.F. J. Cell Biol. 1994; 127: 1233-1243Crossref PubMed Scopus (368) Google Scholar). Also, concomitant with a ∼10-fold increased number of caveolae in fully differentiated 3T3-L1 adipocytes, the levels of caveolin-1 mRNA and protein expression increase ∼20-fold during differentiation from the fibroblastic to the adipocyte phenotype (10Scherer P.E. Lisanti M.P. Baldini G. Sargiacomo M. Corley-Mastick C. Lodish H.F. J. Cell Biol. 1994; 127: 1233-1243Crossref PubMed Scopus (368) Google Scholar). There are possible functional consequences for such high caveolin expression in adipocytes. Photoaffinity labeling has identified caveolin-1 as a major plasma membrane fatty-acid binding protein in adipocytes (11Gerber G.E. Mangroo D. Trigatti B.L. Mol. Cell Biochem. 1993; 123: 39-44Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 12Trigatti B.L. Anderson R.G. Gerber G.E. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 255: 34-39Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Furthermore, caveolin-1 moves from the plasma membrane to lipid droplets in response to free fatty acids (13Pol A. Luetterforst R. Lindsay M. Heino S. Ikonen E. Parton R.G. J. Cell Biol. 2001; 152: 1057-1070Crossref PubMed Scopus (278) Google Scholar, 14Ostermeyer A.G. Paci J.M. Zeng Y. Lublin D.M. Munro S. Brown D.A. J. Cell Biol. 2001; 152: 1071-1078Crossref PubMed Scopus (213) Google Scholar). As such, caveolin-1 is the first known integral membrane protein component of lipid droplets. Based on these studies, it has been proposed that caveolin-1 functions in the transport and/or storage of free fatty acids/triglycerides in lipid droplets. However, no functional data has been presented to support this hypothesis. We and others have recently reported the generation and initial characterization of mice with a disrupted Cav-1 locus. Although these mice are viable and fertile, they show a hyperproliferative lung phenotype and vascular abnormalities due to aberrant endothelial cell function (15Razani B. Engelman J.A. Wang X.B. Schubert W. Zhang X.L. Marks C.B. Macaluso F. Russell R.G. Li M. Di Pestell R.G. Vizio D. Hou Jr., H. Knietz B. Lagaud G. Christ G.J. Edelmann W. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 2001; 276: 38121-38138Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (258) Google Scholar, 16Drab M. Verkade P. Elger M. Kasper M. Lohn M. Lauterbach B. Menne J. Lindschau C. Mende F. Luft F.C. Schedl A. Haller H. Kurzchalia T.V. Science. 2001; 293: 2449-2452Crossref PubMed Scopus (1333) Google Scholar). Perhaps surprisingly, despite the high expression of caveolin-1 in adipose tissue, we and others did not detect any abnormalities on routine histology of abdominal adipose tissue (15Razani B. Engelman J.A. Wang X.B. Schubert W. Zhang X.L. Marks C.B. Macaluso F. Russell R.G. Li M. Di Pestell R.G. Vizio D. Hou Jr., H. Knietz B. Lagaud G. Christ G.J. Edelmann W. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 2001; 276: 38121-38138Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (258) Google Scholar,16Drab M. Verkade P. Elger M. Kasper M. Lohn M. Lauterbach B. Menne J. Lindschau C. Mende F. Luft F.C. Schedl A. Haller H. Kurzchalia T.V. Science. 2001; 293: 2449-2452Crossref PubMed Scopus (1333) Google Scholar). However, follow-up of these mice till 1 year of age revealed significant differences in body weight, i.e. Cav-1 null mice were smaller than their wild-type counterparts. We now report a detailed analysis of this phenotype with the intriguing finding that a deficiency in caveolin-1 causes a gradual decompensation in several adipose tissues and imparts resistance to diet-induced obesity. Furthermore, we find that these mice have de-ranged metabolism of triglycerides and free fatty acids, thereby implicating caveolae and caveolins for the first time as important factors in lipid homeostasis and obesity. Antibodies and their sources were as follows: anti-caveolin-1 mAb 2297 and anti-caveolin-3 mAb 26 (17Scherer P.E. Tang Z.-L. Chun M.C. Sargiacomo M. Lodish H.F. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1995; 270: 16395-16401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (326) Google Scholar, 18Scherer P.E. Lewis R.Y. Volonte D. Engelman J.A. Galbiati F. Couet J. Kohtz D.S. van Donselaar E. Peters P. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1997; 272: 29337-29346Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (479) Google Scholar, 19Song K.S. Scherer P.E. Tang Z.-L. Okamoto T. Li S. Chafel M. Chu C. Kohtz D.S. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15160-15165Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (621) Google Scholar) (gifts of Dr. Roberto Campos-Gonzalez, BD Transduction Laboratories, Inc.); anti-β-tubulin TUB-2.1 (Sigma Chemical Co.). The strategy used to target the caveolin-1 locus and generate Cav-1 null mice was as previously described (15Razani B. Engelman J.A. Wang X.B. Schubert W. Zhang X.L. Marks C.B. Macaluso F. Russell R.G. Li M. Di Pestell R.G. Vizio D. Hou Jr., H. Knietz B. Lagaud G. Christ G.J. Edelmann W. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 2001; 276: 38121-38138Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (258) Google Scholar). All animals used in these studies (mice homozygous null for the caveolin-1 gene and their wild-type littermates) were of a C57BL/6 × sv129 genetic background and were genotyped by PCR, as previously described (15Razani B. Engelman J.A. Wang X.B. Schubert W. Zhang X.L. Marks C.B. Macaluso F. Russell R.G. Li M. Di Pestell R.G. Vizio D. Hou Jr., H. Knietz B. Lagaud G. Christ G.J. Edelmann W. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 2001; 276: 38121-38138Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (258) Google Scholar). Housing and maintenance was provided by the Albert Einstein College of Medicine barrier facility; mice were kept on a 12-h light/dark cycle and, except where noted, had ad libitum access to chow (Picolab 20, PMI Nutrition International) and water. All animal protocols used in this study were pre-approved by the Albert Einstein College of Medicine Institute for Animal Studies. Freshly dissected tissue samples were washed thoroughly with phosphate-buffered saline and either snap-frozen in liquid N2 or immediately homogenized with lysis buffer (10 mm Tris, pH 7.5; 50 mm NaCl; 1% Triton X-100; 60 mm octyl glucoside) containing protease inhibitors (Roche Molecular Biochemicals). Protein concentrations were quantified using the BCA reagent (Pierce), and the volume required for 10 μg of protein was determined. Samples were separated by SDS-PAGE (12.5% acrylamide) and transferred to nitrocellulose. The nitrocellulose membranes were stained with Ponceau S (to visualize protein bands) followed by immunoblot analysis. All subsequent wash buffers contained 10 mm Tris, pH 8.0, 150 mmNaCl, 0.05% Tween 20, which was supplemented with 1% bovine serum albumin and 2% nonfat dry milk (Carnation) for the blocking solution and 1% bovine serum albumin for the antibody diluent. Primary antibodies were used at a 1:500 dilution. Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (1:5000 dilution, Pierce) were used to visualize bound primary antibodies with the Supersignal chemiluminescence substrate (Pierce). Adipose tissue samples (derived from subcutaneous, peri-epididymal, and peri-renal fat depots) were minced with a razor blade into ∼1 mm2 × 1-cm-long strips fixed with 2.5% glutaraldehyde/0.1 m cacodylate, post-fixed with OsO4, and stained with uranyl acetate and lead citrate. A cryotome was used to yield sections of 1-μm thickness, and the samples were examined under a JEOL 1200EX transmission electron microscope and photographed at ×16,000 magnification (20Lisanti M.P. Scherer P.E. Vidugiriene J. Tang Z.-L. Hermanoski-Vosatka A. Tu Y.-H. Cook R.F. Sargiacomo M. J. Cell Biol. 1994; 126: 111-126Crossref PubMed Scopus (839) Google Scholar). Caveolae were identified by their characteristic flask shape, size (50–100 nm), and location at or near the plasma membrane. A cohort of mice (composed of Cav-1(+/+) and Cav-1(−/−) mice) was generated by heterozygous inter-breedings, some of which were placed on a high fat diet (59% of calories derived from fat, Research Diets, D12492), while others were placed on the equivalent chow diet (10% of calories derived from fat, Research Diets, D12450B) (see Fig. 2 A). The diet study was begun upon weaning (3 weeks of age) and continued up to 45 weeks of age. All images were obtained using a 9.4-Tesla magnet (GE Omega vertical wide bore system). Mice were first anesthetized by intraperitoneal injection with a ketamine/xylazine mixture (0.1 ml per 20 g of body weight). To quantitatively assess whole-body fat and water, each mouse was subjected to a 16-scan pulse-acquire sequence in a 40-mm 1H coil, and spectra, including the water and fat peaks, were obtained. For imaging, eight slices of 2-mm thickness spanning the whole body were obtained. Imaging was conducted using a 35-mm 1H coil and a routine spin-echo pulse sequence (18-ms echo time, 600-ms repetition time, and 4-signal averaging per scan). The indicated Cav-1(+/+) or (−/−) mice cohorts were sacrificed at an early age (3 months, when there were insignificant weight differences between wild-type and knockout mice) or at an older age (9 months, when diet-induced weight differences were statistically significant). Several tissues, including the significant white adipose depots (subcutaneous/mammary gland 4, peri-uterine/peri-epididymal, peri-renal/retroperitoneal), the scapular brown adipose depots (inter-scapular and sub-scapular), and the liver were dissected and weighed. For routine histology, similar areas from all tissues were chosen, formalin-fixed, paraffin-embedded, sectioned, and stained with hematoxylin and eosin. All photographs were taken with a Zeiss digital imaging system. VO2, VCO2, body heat, and movements were measured from mice housed individually in Oxymax metabolic chambers (Columbus Instruments) with an air flow of 0.65 liter/min. Measurements were made every 12 min for a 24-h period. Total VO2 (ml/kg/h), VCO2(ml/kg/h), and body heat (kcal/h) are the mean of all measurements made during the 24-h period. Total movements are a tally of the number of times the motion sensors detected movement during the 24-h period. Resting VO2, VCO2, and body heat are the mean of all measurements made during times when mouse movement was limited to <20 per each 12-min measuring period. Respiratory quotient is the ratio of VCO2 to VO2. Mice were placed in individual cages with ad libitum access to both food and water. Food weight was measured, and stool samples were collected daily for a period of 8 days. To collect fresh stools and account for spilled food, cage beddings were changed daily. The fat content of the collected stools was determined as follows: samples (25 mg from each mouse) were ground to a powder form by mortar and pestle and extracted three times with absolute ethanol at 90 °C under reflux. The extracts were dried under a stream of N2 and resuspended in 50% ethanol, and triglyceride content was measured colorimetrically (Sigma). Mouse plasma was drawn from the tail vein and decanted directly into heparinized capillary tubes (Fisher Scientific). Where indicated, fasting blood samples were collected at 7:00 a.m., 12 h after removal of the food, and post-prandial blood samples were collected at 12:00 a.m., 3 h after the beginning of the room's dark cycle. Glucose, cholesterol, triglyceride, and free fatty acid levels were measured with standard enzymatic colorimetric assays (Sigma and Wako Biochemicals). Insulin and leptin levels were determined by radioimmunoassay (RIA) (Linco Research), whereas ACRP30 levels were determined by quantitative immunoblotting with an anti-ACRP30 pAb, as we described previously (21Berg A.H. Combs T.P. Du X. Brownlee M. Scherer P.E. Nat. Med. 2001; 7: 947-953Crossref PubMed Scopus (2242) Google Scholar). For lipoprotein fractionation, plasma samples from 10 mice of the same genotype (150 μl of total plasma) were separated by gel filtration chromatography using two Superose 6HR 10/30 columns in tandem (Amersham Biosciences). A series of 0.5-ml fractions corresponding to the migration of known lipoproteins were collected and subjected to the colorimetric cholesterol and triglyceride assays indicated above. Weight-matched mice were fasted for 8 h before being gavaged with 0.5 ml of olive oil. Blood was collected via the tail vein at baseline and for the indicated times. Due to a rapid initial rise in plasma triglycerides and a slower clearance, blood collection frequency was begun at every 20 min and was gradually tapered over the 24-h time course. Triglycerides were measured with a colorimetric assay (Sigma). Lipase activity was determined essentially as previously described, with minor modifications (22Merkel M. Kako Y. Radner H. Cho I.S. Ramasamy R. Brunzell J.D. Goldberg I.J. Breslow J.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 13841-13846Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar). Heparin (1.5 units/g, Sigma) was injected by tail vein, and blood was collected 5 min later from the retro-orbital plexus (control wild-type and knockout mice were injected with saline). A triglyceride emulsion composed of3H-labeled triolein (PerkinElmer Life Sciences) and cold triolein (Sigma) was prepared, as previously described (23Nilsson-Ehle P. Schotz M.C. J. Lipid Res. 1976; 17: 536-541Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). 12.5 μl of plasma was incubated with the emulsion in the presence or absence of 1.5 m NaCl (a measure of hepatic lipase and total lipase activity, respectively), and the freely released [3H]oleic acid was measured by scintillation counter. The difference between the two lipase activities above yields the measurable lipoprotein lipase activity. All results are presented as mean ± S.E. The statistical significance of the data was determined via the two-tailed Student's t test using Microsoft Excel. Targeted disruption of exons 1 and 2 of the caveolin-1 locus produces a null mutation (15Razani B. Engelman J.A. Wang X.B. Schubert W. Zhang X.L. Marks C.B. Macaluso F. Russell R.G. Li M. Di Pestell R.G. Vizio D. Hou Jr., H. Knietz B. Lagaud G. Christ G.J. Edelmann W. Lisanti M.P. J. Biol. Chem. 2001; 276: 38121-38138Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (258) Google Scholar). Immunoblot analysis of peri-gonadal white adipose tissue (WAT), one of the sites of highest caveolin expression in the mouse, verified that caveolin-1 expression is ablated in the caveolin-1 knockout animals (Fig.1 A). It should also be noted that, in adipose tissue, the heterozygote mice have nearly the same levels of caveolin as wild-types, indicating that loss of one allele is compensated for by the other. To assess the state of adipocytes ultrastructurally, we also performed transmission electron microscopy on the peri-gonadal WAT. Fig. 1 B shows the characteristically marginalized cytoplasm of the Cav-1(+/+) adipocyte and the extremely high number of plasma membrane-associated and invaginated caveolae (see arrows). In contrast, Cav-1 null adipocytes display barren membrane architecture (loss of caveolae), but interestingly have no other overt structural abnormalities. In our follow-up of the progressively older Cav-1 null cohorts, we noticed a tendency for the Cav-1 null mice to remain smaller than their wild-type littermates. In fact, at around 1 year of age, the difference is quantifiable with both the male and female knockout mice being approximately 5–7 g lighter than the wild-type controls (females: 39.8 ± 2.6 g for Cav-1+/+ versus 33.0 ± 2.1 g for Cav-1−/− mice (n = 10 each,p < 0.05) and males: 45.4 ± 2.1 g for Cav-1+/+ versus 40.1 ± 1.1 g for Cav-1 −/− mice (n = 10 each, p < 0.05)). To assess whether the lack of weight gain was due to adiposity or other age-related changes, we placed a cohort of age-matched male and female mice on a high fat diet (59% of calories from fat) and a corresponding chow diet (10% of calories from fat). The follow up of these cohorts up to 36 weeks of age indicated that Cav-1 deficiency imparts dramatic resistance to diet-induced obesity (Fig.2 A). On a high fat diet, all mice maintained normal growth up to 10 weeks of age, at which point the weight differences between Cav-1(−/−) null mice became statistically significant (p < 0.05). At 36 weeks, there is a difference of ∼ 10 g in body weight between wild-type and Cav-1 knockout mice (Fig. 2 A). It is interesting to note that the Cav-1 null mice on the equivalent chow diet also displayed leaner body weights, although not to the same extent as the high fat cohorts, leading us to conclude that the inability to gain weight is due to reduced adiposity in Cav-1(−/−) mice. We first assessed adiposity non-invasively via MRI. Fig. 2 B shows a representative abdominal cross-section of a 35-week-old wild-type and a Cav-1-deficient mouse placed on a high fat diet. Because lipids are rich in proton content and are present in high quantity in WAT, the majority of the signal observed in MRI is fat mass (indicated as white) and water. The difference in fat content between wild-type and knockout mice is striking, with only the omental fat and portions of the peri-renal/retro-peritoneal WAT remaining intact. Of significance are the highly underdeveloped subcutaneous and peri-gonadal fat pads. We also obtained whole-body proton spectra with the goal of quantifying the relative amounts of total body lipids. As shown in Fig.2 B, Cav-1 null mice have a dramatically attenuated fat peak in relation to the water peak. Quantification of such spectra on a group of four wild-type and four Cav-1 knockout mice reveals a 2-fold reduction in the fat-to-water ratio in Cav-1 null mice (Fig.2 B). To more accurately quantitate the regional fat pad differences in 36-week-old high fat diet mice (where the most overt total body weight differences are observed) and contrast these weights with 12-week-old mice (where total body weights are indistinguishable), we dissected and quantitated the weights of three major fat pads (the mammary gland 4/subcutaneous (M4/subQ), the peri-epididymal/peri-uterine, and the peri-renal/retroperitoneal) (Fig. 2 C). At 12 weeks, only one type of adipose tissue is affected in the Cav-1 null mice, the female mammary gland/subcutaneous WAT, where there is over a 2-fold reduction as compared with the wild-type controls. Interestingly, this reduction does not hold for the male knockout mice; rather, the only regional differences are a slight diminishment of peri-epididymal adiposity. We will further elaborate on this finding with histological analysis (see below). At 36 weeks of age on a high fat diet, the robust increase in adiposity of the wild-type mice is evident with 3- to 9-fold increases over the younger wild-type mice (Fig. 2 C). It is intriguing that the Cav-1(−/−) mice undergo only minor gains in fat mass and have dramatically reduced adiposity relative to the wild-type cohorts in all fat pads examined. It should be noted that the difference of the total weight of these three fat pads alone between wild-type and knockout mice accounts for ∼6–7 g of the body weight difference, indicating that the predominant cause of leanness in Cav-1 (−/−) mice is an inability to gain fat mass. We conducted routine histopathology on the 12- and 36-week-old mice above with a focus on WAT from several regions. At 12 weeks, two striking differences could be observed. The Cav-1(−/−) female M4/subQ adipocytes have significantly reduced lipid droplets thereby explaining the reduction in weight at such an early age (Fig.3 A). Additionally, the mammary ducts are noticeably perturbed: The number of ducts per field is increased, and the ductal epithelia exhibit hyperproliferation (data not shown). We further assessed the mammary gland architecture using whole-mount preparations (Fig. 3 B). Although the size of the Cav-1(−/−) mammary glands is overtly reduced, the overall architecture is intact and the total number of ducts per gland does not seem to be altered (quantification of ductal density is also shown (Fig. 3 B, inset)). We therefore conclude that the reduction in mammary gland size in Cav-1 knockout females is primarily due to reduced adipocyte diameter. A second interesting finding at 12 weeks of age is the near complete ablation of adipocytes in the hypodermal fat layer of both Cav-1(−/−) males and females (Fig. 3 A). Normally, the epidermis overlies a layer of adipocytes ∼3–4 cell layers thick; this layer is notably absent in Cav-1-deficient mice. Obviously, the lack of the hypodermal fat layer does not contribute significantly to the reduced body weight of the knockout animals; nevertheless, it is intriguing that there is a selective early effect on the hypodermal and female mammary/subQ WAT. Histological analysis of similar fat pads in the 36-week-old high fat diet mice indicates a systemic effect on adipose tissue. The most highly affected tissues are the mammary gland/subcutaneous and the peri-gonadal WAT in both Cav-1(−/−) males and females, although all fat pads are affected to some degree (Fig. 3 C shows the female M4/subQ WAT and peri-gonadal tissue). There are several notable observations: The M4/subQ in the Cav-1 null females is so severely perturbed that it no longer resembles mammary tissue. The adipocytes are highly reduced in number and display heterogeneity in size, and there is marked interstitial fibrosis and hypercellularity (Fig.3 C, left panel). All other major fat pads examined (the male M4/subQ, the male/female peri-gonadal, and peri-renal/retroperitoneal) show similar histological abnormalities (Fig. 3 C, right panel). Lipid droplet size in Cav-1 null adipocytes is generally ∼2- to 3-fold smaller than in wild-type adipocytes. Additionally, there is marked extracellular matrix deposition and hypercellularity (possibly of adipocyte precursors) surrounding the existing adipocytes. As mentioned above, the initial characterization of Cav-1 null mice revealed abnormalities in the lung and

We investigated the role of autophagy in atherosclerosis. During plaque formation in mice, autophagic markers colocalized predominantly with macrophages (mϕ). Atherosclerotic aortas had elevated levels of p62, suggesting that dysfunctional autophagy is characteristic of plaques. To determine whether autophagy directly influences atherogenesis, we characterized Beclin-1 heterozygous-null and mϕ-specific ATG5-null (ATG5-mϕKO) mice, commonly used models of autophagy haploinsufficiency and deficiency, respectively. Haploinsufficent Beclin-1 mice had no atherosclerotic phenotype, but ATG5-mϕKO mice had increased plaques, suggesting an essential role for basal levels of autophagy in atheroprotection. Defective autophagy is associated with proatherogenic inflammasome activation. Classic inflammasome markers were robustly induced in ATG5-null mϕ, especially when coincubated with cholesterol crystals. Moreover, cholesterol crystals appear to be increased in ATG5-mϕKO plaques, suggesting a potentially vicious cycle of crystal formation and inflammasome activation in autophagy-deficient plaques. These results show that autophagy becomes dysfunctional in atherosclerosis and its deficiency promotes atherosclerosis in part through inflammasome hyperactivation.

ABSTRACT Mitochondrial damage triggers cell death signaling with catastrophic consequences in long-lived and irreplaceable cells, such as cardiac myocytes. Sensing of leaked mitochondrial DNA upon mitochondrial damage is also a potent trigger of inflammation. Whether the innate immune response pathways monitor mitochondrial damage in mitochondria-rich cardiac myocytes to prevent inflammation and cell death, remains unknown. TRAF2, an adaptor protein downstream of innate immune receptors, localizes to the mitochondria in the unstressed heart, with increased mitochondrial targeting in cardiomyopathic human hearts and after cardiac ischemia-reperfusion injury in mice. Inducible cardiomyocyte-specific deletion of TRAF2 in young adult mice impairs mitophagy with rapid decline in mitochondrial quality, upregulates TLR9 expression in cardiac myocytes, and results in inflammation and cell death manifesting as a fulminant cardiomyopathy. Preventing TLR9-mediated mitochondrial DNA sensing and resultant inflammation provides a short-term reprieve from cardiomyopathy, but persistence of damaged mitochondria results in long-term recrudescence. Restoration of wild-type TRAF2, but not the E3 ubiquitin ligase deficient mutant, improves mitochondrial quality and rescues cardiomyopathy to restore homeostasis. Thus, the innate immune response acts via TRAF2 as the first line of defense against mitochondrial damage by orchestrating homeostatic mitophagy to dampen myocardial inflammation and prevent cell death.

ABSTRACT Background Genome-wide association studies revealed a robust association between genetic variants in the LIPA (lysosomal acid lipase) gene and coronary artery diseases (CAD), but not lipid traits. QTL studies support that the risk alleles of LIPA CAD variants are associated with higher LIPA mRNA and enzyme activity in human monocytes. Yet the variant-to-function relationship and how this important locus impacts disease etiology has not been fully established. Herein, we aim to determine the causal variant(s), involved cell type, and the target gene, establish the causality of the variant-to-function relationship, and elucidate how increased myeloid LIPA impacts atherosclerosis in vivo . Methods We apply functional genomic datasets, post-GWAS prioritization pipelines, and molecular biology techniques, incuding eQTL, enzyme activity-QTL, high-resolution Tri-HiC, ChIP-seq, and site-directed mutagenesis and luciferase assay to connect functional variants to the candidate genes in the causal cell type. To establish how increased myeloid LIPA impacts atherosclerosis, we generated myeloid-specific Lipa overexpression mice (Lipa Tg ) . Results Post-GWAS pipelines support LIPA as the candidate causal gene at the locus. In human monocyte-derived macrophages, LIPA mRNA, protein and enzyme activity were higher in the risk allele carriers of CAD variants. High-resolution Tri-HiC and luciferase assay confirmed an intronic enhancer region showing strong interaction with the LIPA promoter. Within the enhancer region, the risk alleles of rs1412444/rs1412445 and rs1320496 demonstrate enhanced binding to PU. 1, and acted as the functional variants with risk alleles leading to increased enhancer activity. The risk allele of rs1320496 is predicted to create a motif binding site for PU.1. The functional genomic data together support that LIPA is the candidate causal gene in the locus, and the risk alleles of CAD led to increased LIPA in a myeloid cell-specific manner. Consistently, mice with myeloid-specific Lipa overexpression on a Ldlr -/- background showed significantly increased atherosclerotic lesion size and lesion macrophage area without affecting plasma cholesterol. ScRNA-seq analysis showed that Lipa Tg led to reduced lipid-enriched yet increased inflammatory macrophage subsets, and activation chemokine signaling pathway. This was further confirmed by reduced neutral lipid accumulation in both plaque and peritoneal macrophages and significantly increased monocytes infiltration into the lesion in Lipa Tg mice. Conclusions We established that LIPA risk alleles drive increased myeloid LIPA and aggravate atherosclerosis. CLINICAL PERSPECTIVE What is New? CAD GWAS variants at the LIPA locus led to increased macrophage LIPA expression and enzyme activity. Myeloid-specific overexpression of Lipa exacerbates atherosclerosis. Our study connected the genetic variation to the involved cell type and the target gene, and the disease mechanism for this important locus. What are the Clinical Implications? GWAS and meta-analyses have identified over 200 loci for CAD. Establishing the candidate genes and their mechanistic studies inform novel biological mechanisms and therapeutic application. There is strong statistical evidence linking LIPA with CAD. By leveraging functional genomic studies and transgenic mice, our work established the direct causality that LIPA risk alleles drive increased myeloid LIPA and aggravate atherosclerosis. Establishing the variant-to-function relationship for this locus informs that increasing myeloid LIPA may not be a therapeutic strategy for CAD, despite the essential role of LIPA in regulating lysosomal lipid metabolism.

Galectin-3 (Gal3) is a β-galactoside-binding lectin predominantly known as a secreted inflammatory biomarker in cardiovascular disease, with significantly elevated circulating levels in patients with atherosclerosis and myocardial infarction. However, the molecular mechanisms of Galectin-3 action and whether its intracellular role contributes to atherogenesis remain unclear. Using several databases of bulk and single cell RNAseq, we first show that Gal3 transcripts are upregulated during plaque progression with particular abundance in the myeloid/macrophage lineage and foamy macrophages. Furthermore, Gal3 transcripts correlate significantly with increases in a network of lysosomal genes, suggesting a possible link between macrophage Gal3 and lysosomal function. Indeed, instigation of lysosome membrane damage in primary macrophages via cholesterol crystals and LLOMe triggers robust recruitment of Gal3 to lysosomes by sensing exposed carbohydrate moieties of proteins including Lamp1. Gal3 recruitment initiates a two-pronged lysosomal recovery program composed of either lysosomal repair involving the ESCRT complex or lysosomal removal and replacement involving autophagy/lysophagy and TFEB-mediated lysosomal biogenesis. Gal3-KO macrophages corroborate these findings displaying blunted ESCRT recruitment, diminished autophagy and TFEB activation, and resultant accumulation of damaged lysosomes. Gal3-deficiency also results in enhanced apoptosis and inflammasome/IL-1β activation upon triggering of lysosomal stress in macrophages. These findings are recapitulated in vivo, where Gal3-null bone marrow transplanted in atherogenic LDLR-null mice yields increased lesion size as well as altered plaque composition with macrophage accumulation, apoptosis, and necrotic core formation, characteristic features of the advanced plaque. Taken together, our data implicate unique and previously unrecognized protective function for intracellular Galectin-3 in macrophages and atherosclerosis which are distinct from its traditional role as an inflammatory biomarker in cardiovascular disease.

ABSTRACT Impairments in carbohydrate, lipid, and amino acid metabolism drive features of plaque instability. However, where these impairments occur within the atheroma remains largely unknown. Therefore, we sought to characterize the spatial distribution of metabolites within stable and unstable atherosclerosis in both the fibrous cap and necrotic core. Atherosclerotic tissue specimens were scored based on the Stary classification scale and subdivided into stable and unstable atheromas. After performing mass spectrometry imaging (MSI) on these samples, we identified over 850 metabolite-related peaks. Using MetaboScape, METASPACE, and HMDB, we confidently annotated 170 of these metabolites and found over 60 of these were different between stable and unstable atheroma. We then integrated these results with an RNA-sequencing dataset comparing stable and unstable human atherosclerosis. Upon integrating our MSI results with the RNA-seq dataset, we discovered that pathways related to lipid metabolism and long-chain fatty acids were enriched in stable plaques, whereas reactive oxygen species, aromatic amino acid, and tryptophan metabolism were increased in unstable plaques. Acylcarnitines and acylglycines were increased in stable plaques whereas tryptophan metabolites were enriched in unstable plaques. Evaluating spatial differences in stable plaques revealed lactic acid in the necrotic core, whereas pyruvic acid was elevated in the fibrous cap. In unstable plaques, 5-hydroxyindole-acetic acid was enriched in the fibrous cap. Our work herein represents the first step to defining an atlas of metabolic pathways involved in plaque destabilization in human atherosclerosis. We anticipate this will be a valuable resource and open new avenues of research in cardiovascular disease. GRAPHICAL ABSTRACT