Primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system (CNS-PNETs) are highly aggressive, poorly differentiated embryonal tumors occurring predominantly in young children but also affecting adolescents and adults. Herein, we demonstrate that a significant proportion of institutionally diagnosed CNS-PNETs display molecular profiles indistinguishable from those of various other well-defined CNS tumor entities, facilitating diagnosis and appropriate therapy for patients with these tumors. From the remaining fraction of CNS-PNETs, we identify four new CNS tumor entities, each associated with a recurrent genetic alteration and distinct histopathological and clinical features. These new molecular entities, designated “CNS neuroblastoma with FOXR2 activation (CNS NB-FOXR2),” “CNS Ewing sarcoma family tumor with CIC alteration (CNS EFT-CIC),” “CNS high-grade neuroepithelial tumor with MN1 alteration (CNS HGNET-MN1),” and “CNS high-grade neuroepithelial tumor with BCOR alteration (CNS HGNET-BCOR),” will enable meaningful clinical trials and the development of therapeutic strategies for patients affected by poorly differentiated CNS tumors.

Abstract Despite improved outcomes with checkpoint blockade immunotherapy, patients with brain metastases have the worst prognosis among patients with metastatic cancer. Immune checkpoint blockade agents target inhibitory receptors, such as PD-1, on exhausted CD8 + T cells to restore their anti-cancer function. Many patients, however, either do not respond or progress after an initial response to immune checkpoint blockade, and distant intracranial failure is common despite excellent options for local treatment of brain metastasis. To develop more effective therapeutic strategies for the treatment of brain metastases, an understanding of the phenotype of brain metastasis-infiltrating CD8 + T cells is essential. Here we performed a detailed characterization of the CD8 + T cells contained in brain metastases. Brain metastases were densely infiltrated by CD8 + T cells; blood contamination of tumor samples was rare. Compared to patient-matched circulating cells, brain metastasis-infiltrating CD8 + T cells had a distinct phenotype characterized by more frequent expression of PD-1, with subpopulations defined by expression of additional co-inhibitory molecules and the residence marker CD69. Single cell RNA-sequencing identified four phenotypic subpopulations within brain metastasis-infiltrating PD-1 + CD8 + T cells. Two of these populations — a terminally-differentiated and a dividing population — were characterized by high expression of co-inhibitory molecules and lacked expression of progenitor markers such as TCF-1. There was significant T cell receptor (TCR) overlap between the terminally-differentiated and dividing populations, suggesting that the dividing cells give rise to the terminally-differentiated cells. There was minimal TCR overlap between these two populations and other brain metastasis-infiltrating PD-1 + CD8 + T cells. T cell clones from brain metastasis-infiltrating CD8 + T cells were rare in circulation, particularly clones from the terminally-differentiated and dividing populations. We systematically identified bystander CD8 + T cells specific for microbial antigens; these cells infiltrated brain metastases and expressed genes shared with exhausted progenitor CD8 + T cells, such as TCF7 and IL7R . We performed spatial transcriptomics on brain metastases and used a novel method to obtain TCR sequences from spatial transcriptomics data. These data revealed distinct niches within the TME defined by their gene expression patterns and cytokine profiles. Terminally-differentiated CD8 + T cells preferentially occupied niches within the tumor parenchyma. Together, our results show that antigen-specificity restricts the spatial localization, phenotypic states, and differentiation pathways available to CD8 + T cells within the brain metastasis TME.

Abstract BACKGROUND Diffuse Leptomeningeal Glioneuronal Tumors (DLGT) typically have a clinical course with slow progression; however, there have been cases of anaplastic transformation. We describe the clinical presentation, radiographic features, and molecular characteristics in 2 pediatric DLGT cases that underwent aggressive transformation. METHODS Patient 1: A 20 y/o male with DLGT with BRAF-KIAA1549 fusion and loss of 1p who was first diagnosed at 2.5 y/o. Over the course of 17 years, he was treated with numerous therapies due to multiple progressions, including temozolomide, carboplatin/vincristine, selumetinib, and vinblastine. At age 17, he developed significant growth of a posterior fossa mass with solid and cystic characteristics. Resection revealed new anaplastic pathologic features. Patient 2: He was diagnosed with DLGT at age 2 y/o. Imaging demonstrated intramedullary spinal nodules at T4 and T5 with abnormal thickening and enhancement over the cerebral leptomeningeal space. A biopsy revealed DLGT with a BRAF-KIAA1549 fusion, 1p loss and Ki67 5%. He received multiple therapies including carboplatin/vincristine, vinblastine, and selumetinib. RESULTS Patient 1: Molecular characterization revealed new ATRX mutation, and CDKN2A/B homozygous deletion. Over the following 2 years, he had multiple treatments, progressions, and surgeries. Final pathology revealed significant anaplasia with Ki67 90%, ATRX loss, and mutation of PPM1D and ARID1A. He rapidly declined. Patient 2: Approximately 2.5 years after diagnosis, he developed rapid progression in the 4th and lateral ventricles. Pathology confirmed recurrent DLGT, but with high-grade transformation, H3K27M (-), H3k27m3 loss, ATRX (+), Ki67 40%. He was treated with focal irradiation followed by temozolomide/CCNU. CONCLUSION In rare cases, DLGT can undergo anaplastic transformation. Once this occurs, it behaves clinically like a high-grade glioma. Understanding the molecular underpinnings and prognostic features that lead to this transformation are important for future study.

Abstract We show that the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) maintains neural identity in Sonic Hedgehog (SHH)-driven cerebellar granule neuron progenitors (CGNPs) and SHH-driven medulloblastoma, a cancer of CGNPs. Proliferating CGNPs and medulloblastoma cells pass the neural fate commitment to their progeny through epigenetic mechanisms. The PRC2 mediates epigenetic regulation through histone methylation, and PRC2 inhibitors have been proposed for medulloblastoma therapy. We investigated PRC2 function in CGNPs and medulloblastoma by conditionally deleting PRC2 components Eed or Ezh2 in CGNPs and analyzing cerebellar growth, cellular gene expression (scRNA-seq), and tumorigenesis in medulloblastoma-prone Smo -mutant mice. Eed -deleted CGNPs showed reduced growth, with decreased proliferation, increased apoptosis and inappropriate myoid differentiation. Ezh2 -deleted CGNPs also showed myoid differentiation without reduced growth. Eed -deleted and Ezh2 -deleted medulloblastomas similarly demonstrated myoid differentiation, but progressed more rapidly than PRC2-intact controls. The PRC2 thus maintained neural fate in CGNPs and medulloblastoma, but PRC2 disruption did not block SHH medulloblastoma progression.

Abstract Little progress has been made to delineate the inflammatory microenvironment in pediatric high-grade glioma (pHGG) and diffuse midline glioma (DMG). We utilize molecularly defined human samples and immunocompetent mouse models to study how tumor location and genetic driver mutations influence the tumor microenvironment (TME). We first induced tumors of each pHGG/DMG molecular subtype (H3WT, H3G34R, H3.1K27M, H3.3K27M) into both the cortical hemisphere and midline of separate mice and performed survival studies and flow cytometry. The main driving factor shaping the immune landscape and survival is the driver mutation, not tumor location. Next, we performed single cell RNA sequencing on murine H3WT cortical pHGG, H3WT DMG, H3.1 and H3.3K27M DMGs, paired with multiplex flow cytometry. H3K27M DMGs have sparse T cell infiltration and limited T cell recruiting chemokine production. The main non-neoplastic cell type in all tumors was infiltrating myeloid cells and microglia. H3WT DMGs had the greatest myeloid cell and monocyte-derived macrophage (MDM) infiltration, while H3.3K27M DMGs were enriched for microglia. Disease associated gene signatures were found in tumor-associated macrophages (TAMs) that are found in other neurodegenerative diseases, marked by down-regulation of inflammatory signaling, interferon responses, and up-regulation of metabolism-related pathways. H3.3K27M DMGs were enriched for disease-associated TAMs. These gene signatures were then identified in human pHGG/DMG scRNA sequencing data. CD16 monocytes and microglia were enriched for diseased signatures, while CD14 monocytes were pro-inflammatory. We demonstrate that reprogramming this diseased signature in mice results in increased T cell infiltration and extension of survival in H3K27M DMG. Last, through pharmacologic inhibition of CCR1 and CCR5, we demonstrate preventing TAM infiltration in DMG results in enhanced survival, comparable to radiation therapy. Together, this work provides the foundation for developing immunotherapies targeted at specific subgroups of pHGG and DMGs, such as CAR-T-cell, oncolytic viral therapy, and checkpoint blockade.