The Schizosaccharomyces pombe hmt1 gene encodes an ABC (ATP-binding cassette)-type protein essential for Cd2+ tolerance. Immunoblot analysis of subcellular fractions indicates that the native HMT1 polypeptide is associated with the vacuolar membrane. Vacuolar membrane vesicles were purified from strains that hyperproduce, or are deficient in, the HMT1 protein. In vitro transport of radiolabeled substrates by these vesicles indicates that HMT1 is an ATP-dependent transporter of phytochelatins, the metal-chelating peptides involved in heavy metal tolerance of plants and certain fungi. Vacuolar vesicles containing HMT1 are capable of taking up both apo-phytochelatins and phytochelatin-Cd2+ complexes. HMT1 activity is sensitive to antibodies directed against this protein and to vanadate, but not to inhibitors affecting the vacuolar proton ATPase or ionophores that abolish the pH gradient across the vacuolar membrane. Vacuolar uptake of Cd2+ and of a glutathione conjugate were also observed, but are not attributable to HMT1. These studies highlight the importance of the yeast vacuole in detoxification of xenobiotics. The Schizosaccharomyces pombe hmt1 gene encodes an ABC (ATP-binding cassette)-type protein essential for Cd2+ tolerance. Immunoblot analysis of subcellular fractions indicates that the native HMT1 polypeptide is associated with the vacuolar membrane. Vacuolar membrane vesicles were purified from strains that hyperproduce, or are deficient in, the HMT1 protein. In vitro transport of radiolabeled substrates by these vesicles indicates that HMT1 is an ATP-dependent transporter of phytochelatins, the metal-chelating peptides involved in heavy metal tolerance of plants and certain fungi. Vacuolar vesicles containing HMT1 are capable of taking up both apo-phytochelatins and phytochelatin-Cd2+ complexes. HMT1 activity is sensitive to antibodies directed against this protein and to vanadate, but not to inhibitors affecting the vacuolar proton ATPase or ionophores that abolish the pH gradient across the vacuolar membrane. Vacuolar uptake of Cd2+ and of a glutathione conjugate were also observed, but are not attributable to HMT1. These studies highlight the importance of the yeast vacuole in detoxification of xenobiotics. INTRODUCTIONABC 1The abbreviations used are: ABCATP-binding cassetteAMP-PNPadenosine 5′-(β,γ-imido)triphosphateGSHglutathioneGSDNPdinitrophenyl-S-glutathioneHMWhigh molecular weightLMWlow molecular weightPCphytochelatinhmtheavy metal toleranceMES4-morpholineethanesulfonic acidCHAPS3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acidHPLChigh performance liquid chromatography. (ATP-binding cassette)-type proteins represent one of the largest known families of membrane transporters(1Higgins C.F. Annu. Rev. Cell Biol. 1992; 8: 67-113Crossref PubMed Scopus (3346) Google Scholar). Members of this superfamily are characterized by the presence of a highly conserved nucleotide-binding domain that is associated with a more variable region capable of spanning the membrane multiple times. DNA sequence analysis indicated that the Schizosaccharomyces pombe hmt1 (heavy metal tolerance 1) gene, essential for Cd2+ tolerance, encodes an ABC-type protein(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). Most eukaryotic ABC-type polypeptides exhibit a duplicated structure, containing two transmembrane and two nucleotide-binding domains. HMT1, on the other hand, has only one of each. The few known eukaryotic ABC-type proteins that exhibit this nonduplicated arrangement reside in internal membranes: rat PMP70 (3Kamijo K. Taketani S. Yokota S. Osumi T. Hashimoto T. J. Biol. Chem. 1990; 265: 4534-4540Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and its human homologue (4Gartner J. Moser H. Valle D. Nature Genet. 1992; 1: 16-23Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar) in the peroxisome and TAP1 and TAP2 in endoplasmic reticulum and cis-Golgi(5Kleijmeer M.J. Kelly A. Geuze H.J. Slot J.W. Townsend A. Trowsdale J. Nature. 1992; 357: 342-344Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar). Previously we reported that an HMT1-β-galactosidase fusion protein was localized to the fission yeast vacuole(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar).ABC-type proteins can mediate tolerance to a wide diversity of cytotoxic agents. Multiple drug resistance proteins from mammals (reviewed in (6Kane S.E. Pastan I. Gottesman M.M. J. Bioenerg. Biomembr. 1990; 22: 593-618Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar) and yeast (7Nishi K. Yoshida M. Nishimura M. Nishikawa M. Nishiyama Horinouchi S. Beppu T. Mol. Microbiol. 1992; 6: 761-769Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 8Balzi E. Wang M. Leterme S. Van Dyck L. Goffeau A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 2206-2214Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) decrease the toxicity of a variety of anti-tumorigenic drugs. Leishmania IgptA confers tolerance to methotrexate and arsenite(9Callahan H.L. Beverley S. J. Biol. Chem. 1991; 266: 18427-18430Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), and a number of bacterial transporters are involved in resistance to antibiotics and environmental toxins (reviewed in (10Fath M.J. Kolter R. Microbiol. Rev. 1993; 57: 995-1017Crossref PubMed Google Scholar). Resistance is achieved by export of the toxic substances from the cell. The intracellular location of the HMT1-β-galactosidase chimera, on the other hand, suggested that this protein might represent the first example of an ABC-type transporter mediating resistance to a toxin by sequestration in an intracellular membrane-bound compartment. The nature of the substrate transported by HMT1, and its role in heavy metal tolerance of fission yeast were not clear.Plants and certain fungi, including S. pombe, respond to heavy metals by inducing synthesis of small peptides known as phytochelatins (PCs)(11Grill E. Winnacker E.L. Zenk M.H. Science. 1985; 230: 674-676Crossref PubMed Scopus (977) Google Scholar, 12Steffens J.C. Hunt D.F. Williams B.G. J. Biol. Chem. 1986; 261: 13879-13882Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 13Ow D.W. Ortiz D.F. Speiser D.M. McCue K.F. Winkelmann G. Winge D.R. Metal Ions in Fungi. Marcel Dekker, New York1994: 339-359Google Scholar). Unlike metallothioneins, PCs are not produced by mRNA translation but are enzymatically synthesized from glutathione (GSH, γ-Glu-Cys-Gly). PCs have the general structure (γ-Glu-Cys)nGly, where n = 2-11, and like metallothioneins, chelate heavy metals by formation of thiolate bonds. Yeast and plant cells exposed to Cd2+ accumulate a low molecular weight (LMW) PC•Cd complex, consisting mostly of PCs and Cd2+, and a high molecular weight (HMW) PC•Cd•S−2 complex, containing acid labile sulfide (14Murasugi A. Wada C. Hayashi Y. J. Biochem. (Tokyo). 1983; 93: 661-664Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 15Reese R.N. White C.A. Winge D.R. Plant Physiol. 1992; 98: 225-229Crossref PubMed Scopus (71) Google Scholar, 16Speiser D.M. Abrahamson S.L. Banuelos G. Ow D.W. Plant Physiol. 1992; 99: 817-821Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar). Genetic and biochemical analyses suggest that production of the sulfide moiety in the HMW PC•Cd•S−2 complex involves the purine biosynthetic pathway(17Speiser D.M. Ortiz D.F. Kreppel L. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. Mol. Cell. Biol. 1992; 12: 5301-5310Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 18Juang H.R. McCue K.F. Ow D.W. Arch. Biochem. Biophys. 1993; 304: 392-401Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar). The HMW complex, a CdS crystallite coated by PC peptides(19Dameron C.T. Reese R.N. Mehra R.K. Kortan A.R. Carrol P.J. Steigerwald M.L. Brus L.E. Winge D.R. Nature. 1989; 338: 596-597Crossref Scopus (631) Google Scholar), has a higher Cd2+-binding capacity than LMW PC•Cd, and the Cd2+ ions are less susceptible to acid displacement(20Reese R.N. Winge D.R. J. Biol. Chem. 1988; 263: 12832-12835Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Although detailed structures for HMW and LMW PC•Cd complexes are not available, it is clear that both are heterogeneous oligomeric aggregates containing multiple PC peptides of variable length.Since overexpression of hmt1 in yeast cells confers enhanced Cd2+ tolerance, as well as accumulation of the metal(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar), it was postulated that HMT1 was involved in vacuolar sequestration of heavy metals or metal-peptide complexes. In this report we describe the localization of native HMT1 protein to vacuolar membranes and the discovery of an ATP-dependent PC transport activity in vacuolar membrane vesicles. We present evidence showing that HMT1 is responsible for this activity and describe the substrate specificity and energy requirements of this transporter. In addition, we observed Cd2+ and glutathione conjugate transport activities in fission yeast vacuolar vesicles lacking detectable amounts of HMT1 protein.MATERIALS AND METHODSYeast StrainsThe S. pombe strain Sp223 (h-, ade6-216, leu1-32, ura4-294) is used as a wild type control in these experiments. The hmt1- mutant, LK100, was derived from Sp223 by ethyl methanesulfonate-induced mutagenesis(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). In most analyses LK100 contains either the yeast expression vector pART1 or pDH35 (pART1 containing an hmt1 cDNA)(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). Cultures were grown at 30°C in S.D. (6.7 g of Difco yeast nitrogen base, 20 g of glucose/liter, adenine and uracil at 20 μg/ml).Antibodies Directed against HMT1A 760-base pair ClaI-MaeIII cDNA fragment encoding amino acids 553-806 of HMT1 was subcloned into the Qiagen pQIA16/17 vector system (pDH60). A 29-kDa His-tagged product, purified by Ni-agarose affinity chromatography from Escherichia coli, was used to immunize rabbits 622 and 623. Antisera 622 and 623 recognized a 29-kDa peptide in E. coli/pDH60 that was isopropyl β-thiogalactopyranoside inducible, but was not detected in E. coli/pQIA16. Preimmune sera failed to recognize this protein. IgG was purified from 622 and 623 antisera using Protein A-agarose (Bio-Rad).Plasmid pDH30(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar), containing an hmt1 cDNA in the pBluescript SK vector (Stratagene), was used for in vitro transcription/translation by the TnT T7 system (Promega) in the presence of [35S]Met (1141 Ci/mmol, DuPont). Canine pancreatic microsomal membranes (Promega) were added according to the manufacturer's instructions. Translation products were immunoprecipitated using Protein A-agarose or directly separated by 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for fluorography.Isolation of Vacuole Membrane VesiclesS. pombe vacuolar vesicles were isolated as described previously (2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar) with the following modifications. All buffers contain 2 mM benzamidine, 4 μg/ml leupeptin, 4 μg/ml pepstatin A, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Spheroplasts were lysed in Buffer A (1.6 M sorbitol, 10 mM MES-Tris, pH 6.9, 0.5 mM MgCl2) with a glass homogenizer. Unlysed cells were pelleted by centrifugation at 2,500 × g for 10 min. A half-volume of Buffer B (Percoll containing 1.6 M sorbitol, 10 mM MES-Tris, pH 6.9, 1 mM MgCl2) was added to the supernatant (final Percoll concentration of 30%) and the vacuoles pelleted at 15,000 × g for 30 min. The vacuole pellet was resuspended in Buffer A with a homogenizer, mixed with a half-volume of Buffer B, layered on a cushion of equal volumes of Buffers A and B (50% Percoll), and pelleted as before. The vacuolar pellet was resuspended in Buffer C (100 mM KCl, 10 mM MES-Tris, pH 6.9, 5 mM MgCl2) and vacuolar membrane vesicles pelleted at 7,000 × g for 10 min. Vacuolar vesicles were resuspended in 0.5-1.5 ml of Buffer C containing 0.25 M sucrose and frozen in liquid nitrogen as 50-μl aliquots.Enzyme AssaysSpecific activities of marker enzymes were compared in total membranes and vacuolar membrane vesicles. To prepare total membranes for marker enzyme analysis, an aliquot of the 2,500 × g cell-free supernatant from the vacuolar preparation was diluted 10-fold with Buffer C and membranes pelleted by centrifugation at 100,000 × g. The particulate fraction was resuspended in Buffer C with 0.25 M sucrose and frozen in liquid nitrogen. α-Mannosidase, cytochrome c-reductase, dipeptidyl aminopeptidase B, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and ATPase activities were measured as described(21Roberts C.J. Raymond C.K. Yamashiro C.T. Stevens T.H. Methods Enzymol. 1991; 194: 644-661Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar). Succinate dehydrogenase (22Ackrell B.A.C. Kearney E.B. Singer T.P. Methods Enzymol. 1978; 53: 466-483Crossref PubMed Scopus (231) Google Scholar) and Golgi GDPase (23Seeger M. Payne G.S. J. Cell Biol. 1992; 118: 531-540Crossref PubMed Scopus (109) Google Scholar) were determined as reported. Quenching of acridine orange fluorescence was measured with a Perkin Elmer LS5 Fluorescence spectrometer(24Crider B.P. Xie X.S. Stone D.K. J. Biol. Chem. 1994; 269: 17379-17381Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), except that EDTA was omitted from the reaction buffer. Protein concentration was determined using the Bradford assay (Bio-Rad) containing 0.05% CHAPS. The values obtained by modified Lowry assay on trichloroacetic acid-precipitated material were not significantly different from those generated with the Bradford assay.Synthesis and Purification of SubstratesSp223 cells grown in 800 ml of S.D. to an A600 of 0.6-0.8 were incubated with 0.25 mCi/liter of [35S]Cys (Amersham, 1300 Ci/mmol) and 0.4 mM CdSO4 for 8 h. Cells were lysed with glass beads in 1.5 volumes of 50 mM Tris, pH 7.6, 100 mM KCl, 0.1 mM CdCl2, 0.5% isoamyl alcohol and centrifuged at 10,000 × g for 10 min. Elution of PC•Cd complexes from DEAE-Sephacel (Pharmacia Biotech Inc.) with a linear KCl gradient (0.2-0.5 M, 10 mM Tris, pH 7.6) generated two well resolved peaks of 35S-labeled material. Extracts labeled with 109CdCl2 instead of [35S]Cys produced an identical column profile. 35S-Labeled fractions were reduced in volume to 4 ml in vacuo and applied to a Sephadex G-50 column as described(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). The positions of 35S peaks in the G-50 elution profile were consistent with purification of HMW and LMW PC•Cd complexes. These peaks could also be labeled by addition of a 109CdCl2 tracer to the sample before loading. Concentrated G-50 column fractions, desalted by Sephadex G-10 chromatography, were used in transport studies. HPLC analysis of the PC•Cd complexes (essentially as described in (25Dameron C.T. Smith B.R. Winge D.R. J. Biol. Chem. 1989; 264: 17355-17360Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), except that trifluoroacetic acid was substituted with 0.1% H3PO4) indicated that the PCs were mostly of n = 2-3, in agreement with Grill et al.(26Grill E. Winnacker E.L. Zenk M.H. FEBS Lett. 1986; 197: 115-120Crossref Scopus (115) Google Scholar), and did not contain GSH. Apo-PCs were prepared from the LMW [35S]PC•Cd complex by acidification to pH 2.0 with 1 N HCl followed by HPLC separation(20Reese R.N. Winge D.R. J. Biol. Chem. 1988; 263: 12832-12835Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). 35S-Labeled HPLC fractions were neutralized and desalted by Sephadex G-10 chromatography. The LMW [35S]PC•Cd complex reconstituted from apo-PCs and Cd2+ was indistinguishable from the native complex by Sephadex G-50 gel filtration or as a substrate in transport assays. A LMW [35S]PC•Cd complex could also be derived from purified HMW [35S]PC•Cd•S−2 complex by acidification with 1 N HCl to pH 2.0 in the presence of 10 mM β-mercaptoethanol(20Reese R.N. Winge D.R. J. Biol. Chem. 1988; 263: 12832-12835Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). After out-gassing the evolved H2S, the reaction was neutralized using NaOH, and subjected to Sephadex G-50 gel chromatography. Greater than 90% of the counts present in the HMW [35S]PC•Cd•S−2 complex were recovered from G-50 as a peak indistinguishable from the native LMW [35S]PC•Cd complex. This same peak could also be labeled by addition of a 109Cd tracer. PC concentration was measured with Ellman's reagent (27Anderson M.E. Methods Enzymol. 1985; 113: 548-555Crossref PubMed Scopus (2393) Google Scholar) and interpolated on a GSH standard curve. Because native PC•Cd complexes are heterogeneous regarding number of peptides per complex and length of peptides, PC concentrations are reported as GSH equivalents. Unlabeled PC•Cd complexes were prepared in essentially the same manner. Cd2+ content of column fractions was quantified by atomic absorption spectroscopy as described previously (2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). 109Cd was incorporated into LMW PC•Cd complexes of known Cd2+ and thiol concentration by incubation with 109CdCl2 for 30 min on ice. Free Cd2+ ions were separated from the LMW [109Cd]PC•Cd complex by G-10 chromatography.[3H]GSSG was prepared from [3H]GSH (300 mCi/mmol, DuPont)(28Kondo T. Dale G.L. Beutler E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1980; 77: 6359-6362Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). The 2,4-dinitrophenyl-S-glutathione conjugate (GSDNP) was enzymatically synthesized from 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (Sigma) and [3H]GSH by glutathione S-transferase (Sigma)(29Awasti Y.C. Garg H.S. Dao D.D. Partridge C.A. Srivastava S.K. Blood. 1981; 58: 733-742Crossref PubMed Google Scholar). [3H]GSDNP was separated from its precursors by thin layer chromatography and quantified by absorbance at 340 nm.Vesicle Filtration AssayVesicle filtration assays were performed at 30°C in 10 mM MES-Tris, pH 7.8, 20 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM creatine phosphate, and 100 μg/ml creatine kinase (Buffer D). 50 μl of thawed vacuolar vesicles (20-50 μg of protein) were resuspended in 200 μl of Buffer D, ATP added to a final concentration of 3 mM, and 50 μl of radiolabeled substrate added 30 s later. At the times indicated in the figures, 50-μl aliquots from the reaction were diluted to 1 ml with ice-cold Buffer D, filtered immediately under light vacuum through a 25-mm GF-C filter (Whatman), and washed with 5 ml of Buffer D. For Cd2+ transport, 50 μl of 48 μM109CdCl2, 100 mCi/mmol (DuPont) was used (8 μM final concentration), and the wash contained 2 mM CdCl2 to reduce nonspecific binding of Cd2+ to membranes. For [3H]GSDNP uptake studies, a final concentration of 50 μM GSDNP was used. For PC uptake studies, a solution containing 50,000 cpm of 35S-labeled PCs (4-8 μM GSH equivalents) was used. For measurement of [109Cd]PC•Cd uptake, the LMW [109Cd]PC•Cd substrate was present at a final concentration of 8 μM Cd2+ and 16.4 μM GSH equivalents. For antibody inhibition of PC uptake, an aliquot of vacuolar vesicles was mixed with Buffer D and incubated on ice for 1 h with preimmune serum, no antibody, or 300 μg of IgG derived from either antiserum 622 or 623. ATP and PC substrates were added and the vesicle filtration assay conducted as above.RESULTShmt1 Encodes a 90-kDa Vacuolar Membrane ProteinAn HMT1-β-galactosidase fusion protein had previously been localized to the vacuolar membrane of S. pombe(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). However, reports indicating that hyperproduction of a membrane protein may result in mislocalization to the vacuole (30Cooper A. Bussey H. J. Cell Biol. 1992; 119: 1459-1468Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar) and that the vacuolar membrane may represent the default sorting pathway for yeast membrane proteins (31Roberts C.J. Nophwehr S.F. Stevens T.H. J. Cell Biol. 1992; 119: 69-83Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar) suggested that addition of the 105-kDa β-galactosidase peptide to the carboxyl terminus of HMT1 may have altered its subcellular sorting. Therefore, the intracellular location of native HMT1 remained uncertain.A 29-kDa peptide, encompassing most of the HMT1 ATP-binding cassette domain, was synthesized in E. coli, purified, and used to raise antibodies (antisera 622 and 623). Both antisera recognized a 90-kDa protein in S. pombe (Fig. 1A) that was not detected by preimmune sera and is consistent with the 90.5-kDa molecular mass predicted for HMT1. The 90-kDa protein was associated with the P100 (100,000 × g precipitable) particulate fraction of S. pombe extracts (lane g), but is not detected in the S100 supernatant (lane e), as expected of an integral membrane protein.Vacuoles were prepared from S. pombe spheroplasts as described under "Materials and Methods." Compared to the particulate fraction of a total cellular extract, purified vacuolar vesicles are highly enriched in vacuolar marker enzymes and impoverished in markers for mitochondrial, Golgi, endoplasmic reticulum, and plasma membranes (Table 1). In the immunoblot in Fig. 1A, lanes loaded with vacuolar membranes (Fig. 1A, lanes a and b) exhibited enrichment of the hmt1 product when compared with total cellular membranes (lanes f and g) despite containing 25-fold less protein. The supernatant overlying the vacuolar pellet was impoverished in HMT1 (lane d), suggesting that this protein is sorted primarily to the vacuolar membrane. Cd2+ treatment of wild type cultures did not alter levels of the 90-kDa protein (not shown).Tabled 1The 90-kDa polypeptide was not detected in total (lane h), or vacuolar (lane c), membranes derived from the Cd2+-sensitive LK100 strain, which bears an hmt1- allele with a nonsense mutation in the 5′ region of the gene(2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). Strains transformed with the pDH35 plasmid accumulate high levels of the hmt1 mRNA (2Ortiz D.F. Kreppel L. Speiser D.M. Scheel G. McDonald G. Ow D.W. EMBO J. 1992; 11: 3491-3499Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar) and 90-kDa peptide (Fig. 1A, lanes a and f and B, lane a).In Vitro Transcription/Translation of hmt1 cDNAIn vitro transcription/translation of the hmt1 cDNA generated a 90-kDa product, but only if canine pancreatic microsomes or Triton X-100 detergent were present in the reaction (Fig. 2A). In vitro translation of other integral membrane proteins (33Zhang J.T. Ling V. J. Biol. Chem. 1991; 266: 18224-18232Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 34Silve S. Volland C.G. Garnier R.J. Chevallier M.R. Haguenauer-Tsapis R. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 1114-1124Crossref PubMed Scopus (82) Google Scholar) also depend on these additives. The apparent Mr of hmt1 translation products obtained with Triton X-100 and canine microsomes was the same, suggesting that the hmt1 gene product was not glycosylated in vitro upon insertion into microsomes. The in vitro translation product also co-migrated with the 90-kDa band present in vacuolar membrane extracts (see Fig. 1B), suggesting that HMT1 may not be glycosylated in vivo either. Translation products were immunoprecipitated with antisera 622 and 623 but not preimmune sera (Fig. 2B). In addition to the 90-kDa product, several smaller peptides generated in the transcription/translation reaction were also recognized by the antisera. Since the antibodies are directed to the carboxyl-terminal ABC domain of HMT1, the smaller products could derive from use of cryptic transcription and/or translation start signals present in the hmt1 cDNA. Highly hydrophobic proteins are translated far less efficiently than soluble polypeptides (up to 40-fold lower than the luciferase and S. pombe ade2 gene products). Use of the next downstream ATG codon, encoding Met-318, as a translational start site would generate a truncated peptide lacking the most hydrophobic region of HMT1. The Mr of seven of the eight smaller peptides present in the translation reaction mixture match the sizes predicted if downstream Met codons were used as intragenic translational start sites. Production of these smaller peptides is not dependent on microsomes or detergent; therefore, their translation might be more efficient than that of the full-length HMT1.Figure 2:In vitro transcription/translation of hmt1 cDNA. A, fluorograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel containing [35S]Met labeled in vitro translation products derived from: (a) pBluescript SK+ canine pancreatic microsomes; (b) pDH30 (pBluescript SK containing an hmt1 cDNA) without additives; (c) pDH30 + 1% Triton X-100; (d) pDH30 + canine pancreatic microsomes. B, fluorograph of immunoprecipitated products from in vitro transcription/translation of pDH30 in the presence of 1% Triton X-100: (a) preimmune serum of rabbit 622; (b) anti-HMT1 antiserum 622; (c) anti-HMT1 antiserum 623.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)[35S]PC Uptake Is HMT1-dependentPossible functions of HMT1 include transport of heavy metals and/or PC-metal complexes. Vacuolar membrane vesicles isolated from mutant (LK100/pART) and HMT1 hyperproducing (LK100/pDH35) strains were tested for uptake of radioactively labeled substrates by the standard vesicle filtration assay. Vesicles derived from the HMT1 hyperproducer exhibited ATP-dependent uptake of in vivo labeled LMW [35S]PC•Cd complex (Fig. 3A). No activity was observed at 0°C, in the absence of ribonucleotides, or with AMP, ADP, or the non-hydrolyzable ATP analog AMP-PNP. Inclusion of a creatine kinase/creatine phosphate ATP-regeneration system resulted in a 1.6-fold increase in initial uptake velocity and maintained linearity of uptake for a longer period of time. LMW PC•Cd uptake has a Km for ATP of 0.38 ± 0.01 mM (Fig. 4). 3 mM UTP, CTP, or GTP sustained 97 ± 3, 62 ± 1, or 54 ± 1%, respectively, of the initial velocity measured with 3 mM ATP in the absence of a regeneration system. Addition of Triton X-100 to vesicles loaded with radiolabeled PCs resulted in a decrease of 35S counts retained on the filter. Furthermore, a decrease in the initial velocity of [35S]PC uptake was observed upon reduction of the internal vesicle space (Fig. 5), suggesting that PCs were transported into the vacuolar vesicles rather than binding to the outside of the membrane.Figure 3:Uptake of 35S-labeled PC•Cd complexes by purified vacuolar membrane vesicles. A, ATP-dependent uptake of LMW PC•Cd. Vacuolar vesicles (20-40 μg of protein) prepared from the hmt1- mutant LK100 bearing the pART1 vector containing an hmt1 cDNA (pDH35) (•, ○) or no insert (□, □) were incubated with 8 μM GSH equivalents of LMW [35S]PC•Cd complex (50,000 cpm) in the presence (•, □) or absence (○, □) of 3 mM ATP and an ATP regeneration system. Aliquots were taken at the times indicated and substrate uptake determined by the vesicle filtration assay. Arrow indicates addition of Triton X-100 to 0.02%. B, comparison of uptake of LMW PC•Cd and HMW PC•Cd•S−2 complex by vacuolar vesicles. Vesicles from LK100/pDH35 were incubated with an equal number of counts (50,000 cpm representing 6 μM GSH equivalents) of LMW [35S]PC•Cd (•) or HMW [35S] PC•Cd•S−2 (▴) in the presence of ATP. Bars represent S.E.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Figure 4:Dependence of PC•Cd uptake on ATP concentration. Double reciprocal plot of data used to calculate the Km of HMT1 for ATP. Linear regression curve was calculated as described(35Wilkinson G.N. Biochem. J. 1961; 80: 324-332Crossref PubMed Scopus (2722) Google Scholar). Inset: initial velocity of LMW [35S]PC•Cd complex uptake (calculated as in Table 2) by LK100/pDH35 vacuolar membrane vesicles measured in the presence of an ATP regeneration system and varying concentrations of ATP. Bars represent S.E.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Figure 5:Inhibition of PC•Cd uptake by reduction of internal vesicle space. Uptake of LMW [35S]PC•Cd complex was measured as described in the legend to Fig. 3 in the presence of 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, and 1.5 M sucrose. The initial uptake velocity (determined as in Table 2) is plotted against the reciprocal of the sucrose concentration. Bars represent S.E.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Unlike vesicles derived from the HMT1 hyperproducing strain, LK100/pART1 vacuolar membrane vesicles exhibited no ATP-dependent transport of the LMW [35S]PC•Cd complex (Fig. 3A). Very little activity was observed with membrane vesicles derived from Sp223/pART1 (not shown), probably because of the relatively low level of HMT1 protein present in wild type vacuoles (compare lanes a and b in Fig. 1B) and low specific activity

Research Article1 October 1992free access Heavy metal tolerance in the fission yeast requires an ATP-binding cassette-type vacuolar membrane transporter. D.F. Ortiz D.F. Ortiz Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author L. Kreppel L. Kreppel Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author D.M. Speiser D.M. Speiser Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author G. Scheel G. Scheel Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author G. McDonald G. McDonald Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author D.W. Ow D.W. Ow Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author D.F. Ortiz D.F. Ortiz Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author L. Kreppel L. Kreppel Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author D.M. Speiser D.M. Speiser Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author G. Scheel G. Scheel Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author G. McDonald G. McDonald Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author D.W. Ow D.W. Ow Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. Search for more papers by this author Author Information D.F. Ortiz1, L. Kreppel1, D.M. Speiser1, G. Scheel1, G. McDonald1 and D.W. Ow1 1Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture, Albany, CA 94710. The EMBO Journal (1992)11:3491-3499https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1992.tb05431.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info In response to heavy metal stress, plants and certain fungi, such as the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, synthesize small metal-binding peptides known as phytochelatins. We have identified a cadmium sensitive S. pombe mutant deficient in the accumulation of a sulfide-containing phytochelatin-cadmium complex, and have isolated the gene, designated hmt1, that complements this mutant. The deduced protein sequence of the hmt1 gene product shares sequence identity with the family of ABC (ATP-binding cassette)-type transport proteins which includes the mammalian P-glycoproteins and CFTR, suggesting that the encoded product is an integral membrane protein. Analysis of fractionated fission yeast cell components indicates that the HMT1 polypeptide is associated with the vacuolar membrane. Additionally, fission yeast strains harboring an hmt1-expressing multicopy plasmid exhibit enhanced metal tolerance along with a higher intracellular level of cadmium, implying a relationship between HMT1 mediated transport and compartmentalization of heavy metals. This suggests that tissue-specific overproduction of a functional hmt1 product in transgenic plants might be a means to alter the tissue localization of these elements, such as for sequestering heavy metals away from consumable parts of crop plants. Previous ArticleNext Article Volume 11Issue 101 October 1992In this issue RelatedDetailsLoading ...

Despite the beneficial therapeutic effects of intravenous immunoglobulin (IVIg) in inflammatory diseases, consistent therapeutic efficacy and potency remain major limitations for patients and physicians using IVIg. These limitations have stimulated a desire to generate therapeutic alternatives that could leverage the broad mechanisms of action of IVIg while improving therapeutic consistency and potency. The identification of the important anti-inflammatory role of fragment crystallizable domain (Fc) sialylation has presented an opportunity to develop more potent Ig therapies. However, translating this concept to potent anti-inflammatory therapeutics has been hampered by the difficulty of generating suitable sialylated products for clinical use. Therefore, we set out to develop the first, to our knowledge, robust and scalable process for generating a well-qualified sialylated IVIg drug candidate with maximum Fc sialylation devoid of unwanted alterations to the IVIg mixture. Here, we describe a controlled enzymatic, scalable process to produce a tetra-Fc-sialylated (s4-IVIg) IVIg drug candidate and its qualification across a wide panel of analytic assays, including physicochemical, pharmacokinetic, biodistribution, and in vivo animal models of inflammation. Our in vivo characterization of this drug candidate revealed consistent, enhanced anti-inflammatory activity up to 10-fold higher than IVIg across different animal models. To our knowledge, this candidate represents the first s4-IVIg suitable for clinical use; it is also a valuable therapeutic alternative with more consistent and potent anti-inflammatory activity.

The Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1 (ENPP1) ectoenzyme regulates vascular intimal proliferation and mineralization of bone and soft tissues.

Carotenoids are organic pigment molecules that play important roles in signalling, control of oxidative stress, and immunity. Fish allocate carotenoids to their eggs, which gives them the typical yellow to red colouration and supports their resistance against microbial infections. However, it is still unclear whether carotenoids act mainly as a shield against infection or are used up during the embryos immune defence. We investigated this question with experimental families produced from wild-caught brown trout (Salmo trutta). Singly raised embryos were either exposed to the bacterial pathogen Pseudomonas fluorescens or sham-treated at one of two stages during their development. A previous study on these experimental families reported positive effects of egg carotenoids on embryo growth and resistance against the infection. Here, we quantified carotenoid consumption in these infected and sham-infected maternal sib groups. We found that carotenoid contents mostly decreased during embryogenesis. However, these decreases were neither linked to the virulence induced by the pathogen nor dependent on the time point of infection. We conclude that egg carotenoids are not significantly used up by the embryos immune defence.

A safe and efficient lithium‐ion battery requires including an additive in the electrolyte. Among the additives used, vinylene carbonate (VC) is particularly interesting, because it leads to the formation of a stable and protective solid electrolyte interphase (SEI) on the negative electrode. However, the reduction behavior of VC, resulting in polymer formation, is complex, and many questions remain as to the corresponding reaction mechanisms. In particular, in conventional battery studies, it is not possible to observe the transient species formed during reduction. Using picosecond pulsed radiolysis coupled with theoretical chemistry calculations, we showed that, once formed, the anion radical VC·− can undergo ring opening in a few nanoseconds or form (VC)2·−. Within 100 ns, each of these anions then leads to the formation of (VC)(C3H2O3·−). This latter species starts oligomerizing. Eventually, a polymer is formed. Although it mainly consists of poly(VC) units, other chemical functions, such as alkyl groups, are also present, which highlights the role played by water, even in trace amounts. Lastly, we propose a scheme of the reaction mechanisms involved in VC reduction, leading to its polymerization. Clearly, the polymer formed from VC at the SEI of lithium‐ion batteries has a complex structure.

ABSTRACT Continuous fluidic sampling systems allow collection of brain biomarkers in vivo . Here, we propose a new sampling paradigm, Droplet on Demand (DoD), implemented in a microfabricated neural probe. It allows sampling droplets loaded with molecules from the brain extracellular fluid punctually, without the long transient equilibration periods typical of continuous methods. It uses an accurate fluidic sequence and correct operation is verified by the embedded electrodes. As a proof of concept, we demonstrated the application of this novel approach in vitro and in vivo , to collect glucose in the brain of mice, with a temporal resolution of 1-2 minutes and without transient regime. Absolute quantification of the glucose level in the samples was performed by direct infusion nanoelectrospray ionization Fourier transform mass spectrometry (nanoESI-FTMS). By adjusting the diffusion time and the perfusion volume of DoD, the fraction of molecules recovered in the samples can be tuned to mirror the tissue concentration at accurate points in time. This makes quantification of biomarkers in the brain possible within acute experiments of only 20 to 120 minutes. DoD provides a complementary tool to continuous microdialysis and push-pull sampling probes. The advances allowed by DoD will benefit quantitative molecular studies in the brain, namely for molecules involved in volume transmission or for protein aggregates that form in neurodegenerative diseases over long periods. Abstract Figure

Abstract The billion tons of synthetic polymer-based materials ( i.e. plastics) produced every year are one of the greatest challenges that humanity has to face. Nature produces even more natural polymers, yet they are sustainable. For example, proteins are sequence-defined natural polymers, that are constantly recycled when living systems feed. Indeed, digestion is the protein depolymerization into amino acids ( i.e. the monomers) followed by their re-assembly into new proteins of arbitrarily different sequence and function. This process breaks a common recycling paradigm where a material is recycled into itself. Organisms feed of random protein mixtures that are ‘recycled’ into new proteins whose identity depends on the cell’s needs at the time of protein synthesis. Currently, advanced materials are increasingly made of proteins, but the abovementioned ideal recyclability of such materials has yet to be recognized and established. In this study mixtures of several (up to >30) peptides and/or proteins were depolymerized into their amino acid constituents, and these amino acids were used to synthesize new fluorescent, and bio-active proteins extra-cellularly by using an amino acid-free cell-free transcription-translation system. Proteins with high relevance in materials engineering (β-lactoglobulin films, used for water filtration, or silk fibroin solutions) were successfully recycled into biotechnologically relevant proteins (green, and red fluorescent proteins, catechol 2,3-dioxygenase). The potential long-term impact of this approach to recycling lies in its compatibility with circular-economy models where raw materials remain in use as long as possible, thus reducing the burden on the planet.

Nature has the ability of circularly re-using its components to produce molecules and materials it needs. An example is the ability of most living organisms of digesting proteins they feed off into amino acids and then using such amino acids in the ribosomal synthesis of new proteins. Recently, we have shown that such recycling of proteins can be reproduced outside living organisms. The key proteins’ feature that allows for this type of recycling is their being sequence-defined polymers. Arguably, Nature’s most famous sequence-defined polymer is DNA. Here we show that it is possible starting from sheared calf-DNA to obtain all the four nucleotides as monophosphate-nucleotides (dNMPs). These dNMPs were phosphorylated in a one-pot, multi-enzymes, phosphorylation reaction to generate triphosphate-nucleotides (dNTPs). Finally, we used the dNTPs so achieved (with a global yield of ∼60%) as reagents for PCR (polymerase chain reaction) to produce target DNA strands, and for the diagnose of targeted DNA by quantitative PCR (qPCR). This approach is an efficient, convenient, and environmentally friendly way to produce dNTPs and DNA through recycling according to the paradigm of circular economy.