Single-cell consensus clustering (SC3) provides user-friendly, robust and accurate cell clustering as well as downstream analysis for single-cell RNA-seq data. Single-cell RNA-seq enables the quantitative characterization of cell types based on global transcriptome profiles. We present single-cell consensus clustering (SC3), a user-friendly tool for unsupervised clustering, which achieves high accuracy and robustness by combining multiple clustering solutions through a consensus approach ( http://bioconductor.org/packages/SC3 ). We demonstrate that SC3 is capable of identifying subclones from the transcriptomes of neoplastic cells collected from patients.

The recent advent of methods for high-throughput single-cell molecular profiling has catalyzed a growing sense in the scientific community that the time is ripe to complete the 150-year-old effort to identify all cell types in the human body. The Human Cell Atlas Project is an international collaborative effort that aims to define all human cell types in terms of distinctive molecular profiles (such as gene expression profiles) and to connect this information with classical cellular descriptions (such as location and morphology). An open comprehensive reference map of the molecular state of cells in healthy human tissues would propel the systematic study of physiological states, developmental trajectories, regulatory circuitry and interactions of cells, and also provide a framework for understanding cellular dysregulation in human disease. Here we describe the idea, its potential utility, early proofs-of-concept, and some design considerations for the Human Cell Atlas, including a commitment to open data, code, and community.

Dynamic epigenetic modification of the genome occurs during early development of the mouse. Active demethylation of the paternal genome occurs in the zygote, followed by passive demethylation during cleavage stages, and de novo methylation, which is thought to happen after implantation. We have investigated these processes by using indirect immunofluoresence with an antibody to 5-methyl cytosine. In contrast to previous work, we show that demethylation of the male pronucleus is completed within 4 h of fertilisation. This activity is intricately linked with and not separable from pronucleus formation. In conditions permissive for polyspermy, up to five male pronuclei underwent demethylation in the same oocyte. Paternal demethylation in fertilised oocytes deficient for MBD2, the only candidate demethylase, occurred normally. Passive loss of methylation occurred in a stepwise fashion up to the morulae stage without any evidence of spatial compartmentalisation. De novo methylation was observed specifically in the inner cell mass (ICM) but not in the trophectoderm of the blastocyst and hence may have an important role in early lineage specification. This is the first complete and detailed analysis of the epigenetic reprogramming cycle during preimplantation development. The three phases of methylation reprogramming may have roles in imprinting, the control of gene expression, and the establishment of nuclear totipotency.

Genome-wide epigenetic reprogramming in mammalian germ cells, zygote and early embryos, plays a crucial role in regulating genome functions at critical stages of development. We show here that mouse primordial germ cells (PGCs) exhibit dynamic changes in epigenetic modifications between days 10.5 and 12.5 post coitum (dpc). First, contrary to previous suggestions, we show that PGCs do indeed acquire genome-wide de novo methylation during early development and migration into the genital ridge. However, following their entry into the genital ridge, there is rapid erasure of DNA methylation of regions within imprinted and non-imprinted loci. For most genes, the erasure commences simultaneously in PGCs in both male and female embryos, which is completed within 1 day of development. Based on the kinetics of this process, we suggest that this is an active demethylation process initiated upon the entry of PGCs into the gonadal anlagen. The timing of reprogramming in PGCs is crucial since it ensures that germ cells of both sexes acquire an equivalent epigenetic state prior to the differentiation of the definitive male and female germ cells in which new parental imprints are established subsequently. Some repetitive elements, however, show incomplete erasure, which may be essential for chromosome stability and for preventing activation of transposons to reduce the risk of germline mutations. Aberrant epigenetic reprogramming in the germ line would cause the inheritance of epimutations that may have consequences for human diseases as suggested by studies on mouse models.

The intranuclear position of many genes has been correlated with their activity state, suggesting that migration to functional subcompartments may influence gene expression. Indeed, nascent RNA production and RNA polymerase II seem to be localized into discrete foci or 'transcription factories'. Current estimates from cultured cells indicate that multiple genes could occupy the same factory, although this has not yet been observed. Here we show that, during transcription in vivo, distal genes colocalize to the same transcription factory at high frequencies. Active genes are dynamically organized into shared nuclear subcompartments, and movement into or out of these factories results in activation or abatement of transcription. Thus, rather than recruiting and assembling transcription complexes, active genes migrate to preassembled transcription sites.

Single-cell bisulfite sequencing (scBS-seq) allows robust DNA methylation analysis in rare cells and heterogeneous populations. We report a single-cell bisulfite sequencing (scBS-seq) method that can be used to accurately measure DNA methylation at up to 48.4% of CpG sites. Embryonic stem cells grown in serum or in 2i medium displayed epigenetic heterogeneity, with '2i-like' cells present in serum culture. Integration of 12 individual mouse oocyte datasets largely recapitulated the whole DNA methylome, which makes scBS-seq a versatile tool to explore DNA methylation in rare cells and heterogeneous populations.

Mouse embryos undergo genome-wide methylation reprogramming by demethylation in early preimplantation development, followed by remethylation thereafter. Here we show that genome-wide reprogramming is conserved in several mammalian species and ask whether it also occurs in embryos cloned with the use of highly methylated somatic donor nuclei. Normal bovine, rat, and pig zygotes showed a demethylated paternal genome, suggesting active demethylation. In bovine embryos methylation was further reduced during cleavage up to the eight-cell stage, and this reduction in methylation was followed by de novo methylation by the 16-cell stage. In cloned one-cell embryos there was a reduction in methylation consistent with active demethylation, but no further demethylation occurred subsequently. Instead, de novo methylation and nuclear reorganization of methylation patterns resembling those of differentiated cells occurred precociously in many cloned embryos. Cloned, but not normal, morulae had highly methylated nuclei in all blastomeres that resembled those of the fibroblast donor cells. Our study shows that epigenetic reprogramming occurs aberrantly in most cloned embryos; incomplete reprogramming may contribute to the low efficiency of cloning.

DNA methylation is essential for the control of a number of biological mechanisms in mammals [1Jaenisch R DNA methylation and imprinting: why bother?.Trends Genet. 1997; 13: 323-329Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar]. Mammalian development is accompanied by two major waves of genome-wide demethylation and remethylation: one during germ-cell development and the other after fertilisation [2Surani M.A Imprinting and the initiation of gene silencing in the germ-line.Cell. 1998; 93: 309-312Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (285) Google Scholar, 3Monk M Boubelik M Lehnert S Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development.Development. 1987; 99: 371-382Crossref PubMed Google Scholar, 4Kafri T Ariel M Brandeis M Shemer R Urven L McCarrey J et al.Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line.Genes Dev. 1992; 6: 705-714Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar, 5Sanford J.P Clark H.J Chapman V.M Rossant J Differences in DNA methylation during oogenesis and spermatogenesis and their persistence during early embryogenesis in the mouse.Genes Dev. 1987; 1: 1039-1046Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar, 6Howlett S.K Reik W Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development.Development. 1991; 113: 119-127Crossref PubMed Google Scholar, 7Rougier N Bourchis D Gomes D.M Niveleau A Plachot M Paldi A et al.Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation development.Genes Dev. 1998; 12: 2108-2113Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar]. Most previous studies have suggested that the genome-wide demethylation observed after fertilisation occurs passively, that is, by the lack of maintenance methylation following DNA replication and cell division [6Howlett S.K Reik W Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development.Development. 1991; 113: 119-127Crossref PubMed Google Scholar, 7Rougier N Bourchis D Gomes D.M Niveleau A Plachot M Paldi A et al.Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation development.Genes Dev. 1998; 12: 2108-2113Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar], although one other study has reported that replication-independent demethylation may also occur during early embryogenesis [8Kafri T Gao X Razin A Mechanistic aspects of genome-wide demethylation in the preimplantation mouse embryo.Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 10558-10562Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar]. Here, we report that genes that are highly methylated in sperm are rapidly demethylated in the zygote only hours after fertilisation, before the first round of DNA replication commences. By contrast, the oocyte-derived maternal alleles are unaffected by this reprogramming. They either remain methylated after fertilisation or become further methylated de novo. These results provide the first direct evidence for active demethylation of single-copy genes in the mammalian zygote and, moreover, reveal a striking asymmetry in epigenetic methylation reprogramming. Whereas paternally (sperm)-derived sequences are exposed to putative active demethylases in the oocyte cytoplasm, maternally (oocyte)-derived sequences are protected from this reaction. These results, whose generality is supported by findings of Mayer et al.[9Mayer W Nivelau A Walter J Fundele R Haaf T Demethylation of the zygotic paternal genome.Nature. 2000; 403: 501-502Crossref PubMed Scopus (1056) Google Scholar], have important implications for the establishment of biparental genetic totipotency after fertilisation, the establishment and maintenance of genomic imprinting, and the reprogramming of somatic cells during cloning.

Genome-wide DNA methylation reprogramming occurs in mouse primordial germ cells (PGCs) and preimplantation embryos, but the precise dynamics and biological outcomes are largely unknown. We have carried out whole-genome bisulfite sequencing (BS-Seq) and RNA-Seq across key stages from E6.5 epiblast to E16.5 PGCs. Global loss of methylation takes place during PGC expansion and migration with evidence for passive demethylation, but sequences that carry long-term epigenetic memory (imprints, CpG islands on the X chromosome, germline-specific genes) only become demethylated upon entry of PGCs into the gonads. The transcriptional profile of PGCs is tightly controlled despite global hypomethylation, with transient expression of the pluripotency network, suggesting that reprogramming and pluripotency are inextricably linked. Our results provide a framework for the understanding of the epigenetic ground state of pluripotency in the germline.