ABSTRACT Epsins are endocytic adaptor proteins involved in the internalization of important membrane proteins such as EGFR and Notch ligands. Therefore, this protein family impacts critical signaling pathways and processes such as cell migration and cytokinesis and is ultimately required for embryo development in mammals and cell viability in yeast. Intriguingly, although Epsins are conserved and display similar binding determinants, the process of endocytosis in yeast and mammals exhibit some dramatic mechanistic differences. Therefore, we wondered if the function of Epsins in these organisms are similar and are similarly regulated or they also differ. Since proper and timely localization is needed for function, we determined what elements target Epsins to endocytic sites in yeast vs mammals. Specifically, using a systematic/combinatorial mutagenesis approach we produced a collection of yeast and human Epsin mutated variants that was tested for localization at endocytic sites and for function. Our results showed that the intrinsically disordered carboxy-terminus holds the major determinants (involved in binding of ubiquitin, AP2, clathrin and EH domain-containing proteins) for proper intracellular localization of different Epsin paralogs and homologs in yeast and mammals, while also having a major impact on function. Importantly, we established hierarchies of carboxy-terminal binding determinants for sustaining Epsin localization which turned to be different for human vs. yeast cells; favoring clathrin and AP2 binding in the former and recognition of cargo and EH domain-containing proteins for the latter. Further, we found evidence in both systems that yeast Epsins also use for localization regions of the protein that were until now of unknown functional relevance, i.e., glutamine-rich sequences. Interestingly, some molecular determinants within the Epsin molecule seem to have functional importance beyond its contribution to localization to endocytic sites. Based on these findings, we propose working models for Epsin function and recruitment to membranes/endocytic sites at different maturation stages.

It is well-known that in addition to its classical role in protein turnover, ubiquitination is required for a variety of membrane protein sorting events. However, and despite substantial progress in the field, a long-standing question remains: given that all ubiquitin (Ub) units are identical, how do different elements of the sorting machinery recognize their specific cargoes? Here we provide an answer to this question as we discovered a mechanism based on the coincidence detection of lysine ubiquitination and Ser/Thr phosphorylation for the endocytic adaptor epsin to mediate the internalization of the yeast Na+ pump Ena1. Internalization of Ena1-GFP was abolished in double epsin knock-out in S. cerevisiae and was rescued by re-introducing either one of the 2 yeast epsins, Ent1 or Ent2 in an UIM (Ub Interacting Motif)-dependent manner. Further, our results indicate that ubiquitination of its C-terminal Lys1090 is needed for internalization of Ena1 and requires the arrestin-related-trafficking adaptor, Art3. We determined that in addition to ubiquitination of K1090, the presence of a Ser/Thr-rich patch (S1076TST1079) within Ena1 was also essential for its internalization. Our results suggest that this ST motif is targeted for phosphorylation by casein kinases. Nevertheless, phosphorylation of this S/T patch was not required for ubiquitination. Instead, ubiquitination of K1090 and phosphorylation of the ST motif were independently needed for epsin-mediated internalization of Ena1. We propose a model in which a dual detection mechanism is used by Ub-binding elements of the sorting machinery to differentiate among multiple Ub-cargoes.