C9ORF72-associated Motor Neuron Disease patients feature abnormal expression of 5 dipeptide repeat (DPR) polymers. Here we used quantitative proteomics in a Neuro2a cell model to demonstrate that the valency of Arg in the most toxic DPRS, PR and GR, drives promiscuous binding to the proteome, compared to a relative sparse binding of the more inert AP and GA. Notable targets included ribosomal proteins, translation initiation factors and translation elongation factors. PR and GR comprising more than 10 repeats robustly stalled the ribosome suggesting high-valency Arg electrostatically jams the ribosome exit tunnel during synthesis. Poly-GR also bound to arginine methylases and induced hypomethylation of endogenous proteins, with a profound destabilization of the actin cytoskeleton. Our findings point to arginine in GR and PR polymers as multivalent toxins to translation as well as arginine methylation with concomitant downstream effects on widespread biological processes including ribosome biogenesis, mRNA splicing and cytoskeleton assembly.

Abstract Mutations that cause Huntington’s Disease involve a polyglutamine (polyQ) sequence expansion beyond 35 repeats in exon 1 of Huntingtin. Intracellular inclusion bodies of mutant Huntingtin protein are a key feature of Huntington’s disease brain pathology. We previously showed that in cell culture the formation of inclusions involved the assembly of disordered structures of mHtt exon 1 fragments (Httex1) and they were enriched with translational machinery when first formed. We hypothesized that nascent mutant Httex1 chains co-aggregate during translation by phase separation into liquid-like disordered aggregates and then convert to more rigid, amyloid structures. Here we further examined the mechanisms of inclusion assembly in a human epithelial kidney (AD293) cell culture model and examined whether ribosome quality control machinery previously implicated in stalled ribosomes were involved. We found mHttex1 did not appear to stall translation of its own nascent chain and there was no recruitment of RNA into inclusions. However, proteins involved in translation or ribosome quality control were co-recruited into the inclusions (Ltn1 and Rack1) compared to a protein not anticipated to be involved (NACAD). Furthermore, we observed co-aggregation with other proteins previously identified in inclusions, including Upf-1 and chaperone-like proteins Sgta and Hspb1, which also suppressed aggregation at high co-expression levels. The newly formed inclusions contained immobile mHttex1 molecules which points to the disordered aggregates being mechanically rigid prior to amyloid formation.