Many cofactors bind the hormone-activated estrogen receptor (ER), yet the specific regulators of endogenous ER-mediated gene transcription are unknown. Using chromatin immunoprecipitation (ChIP), we find that ER and a number of coactivators rapidly associate with estrogen responsive promoters following estrogen treatment in a cyclic fashion that is not predicted by current models of hormone activation. Cycles of ER complex assembly are followed by transcription. In contrast, the anti-estrogen tamoxifen (TAM) recruits corepressors but not coactivators. Using a genetic approach, we show that recruitment of the p160 class of coactivators is sufficient for gene activation and for the growth stimulatory actions of estrogen in breast cancer supporting a model in which ER cofactors play unique roles in estrogen signaling.

Selective estrogen receptor modulators (SERMs) mimic estrogen action in certain tissues while opposing it in others. The therapeutic effectiveness of SERMs such as tamoxifen and raloxifene in breast cancer depends on their antiestrogenic activity. In the uterus, however, tamoxifen is estrogenic. Here, we show that both tamoxifen and raloxifene induce the recruitment of corepressors to target gene promoters in mammary cells. In endometrial cells, tamoxifen, but not raloxifene, acts like estrogen by stimulating the recruitment of coactivators to a subset of genes. The estrogen-like activity of tamoxifen in the uterus requires a high level of steroid receptor coactivator 1 (SRC-1) expression. Thus cell type– and promoter-specific differences in coregulator recruitment determine the cellular response to SERMs.

Androgen receptor (AR) is required for sexual differentiation and is implicated in the development of prostate cancer. Here we describe distinct functions for cofactor proteins and gene regulatory elements in the assembly of AR-mediated transcription complexes. The formation of an activation complex involves AR, coactivators, and RNA polymerase II recruitment to both the enhancer and promoter, whereas the formation of a repression complex involves factors bound only at the promoter and not the enhancer. These results suggest a model for the functional coordination between the promoter and enhancer in which communication between these elements is established through shared coactivators in the AR transcription complex.

Lysine-specific demethylase 1 (LSD1) exerts pathway-specific activity in animal development and has been linked to several high-risk cancers. Here, we report that LSD1 is an integral component of the Mi-2/nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) complex. Transcriptional target analysis revealed that the LSD1/NuRD complexes regulate several cellular signaling pathways including TGFβ1 signaling pathway that are critically involved in cell proliferation, survival, and epithelial-to-mesenchymal transition. We demonstrated that LSD1 inhibits the invasion of breast cancer cells in vitro and suppresses breast cancer metastatic potential in vivo. We found that LSD1 is downregulated in breast carcinomas and that its level of expression is negatively correlated with that of TGFβ1. Our data provide a molecular basis for the interplay of histone demethylation and deacetylation in chromatin remodeling. By enlisting LSD1, the NuRD complex expands its chromatin remodeling capacity to include ATPase, histone deacetylase, and histone demethylase.

Nature Communications 3: Article number: 712 (2012); Published: 6 March 2012; Updated: 25 October 2013. Concern was raised over the level of processing of the images in Fig. 2b in this Article. Because the original blots were no longer available, the experiment was repeated and the results presentedin the new Fig.

SOX genes encode a family of high-mobility group transcription factors that play critical roles in organogenesis. The functional specificity of different SOX proteins and the tissue specificity of a particular SOX factor are largely determined by the differential partnership of SOX transcription factors with other transcription regulators, many of which have not yet been discovered. Virtually all members of the SOX family have been found to be deregulated in a wide variety of tumors. However, little is known about the cellular and molecular behaviors involved in the oncogenic potential of SOX proteins. Using cell culture experiments, tissue analysis, molecular profiling, and animal studies, we report here that SOX2 promotes cell proliferation and tumorigenesis by facilitating the G1/S transition and through its transcription regulation of the CCND1 gene in breast cancer cells. In addition, we identified β-catenin as the transcription partner for SOX2 and demonstrated that SOX2 andβ-catenin act in synergy in the transcription regulation of CCND1 in breast cancer cells. Our experiments not only determined a role for SOX2 in mammary tumorigenesis but also revealed another activity of the multifunctional protein, β-catenin. SOX genes encode a family of high-mobility group transcription factors that play critical roles in organogenesis. The functional specificity of different SOX proteins and the tissue specificity of a particular SOX factor are largely determined by the differential partnership of SOX transcription factors with other transcription regulators, many of which have not yet been discovered. Virtually all members of the SOX family have been found to be deregulated in a wide variety of tumors. However, little is known about the cellular and molecular behaviors involved in the oncogenic potential of SOX proteins. Using cell culture experiments, tissue analysis, molecular profiling, and animal studies, we report here that SOX2 promotes cell proliferation and tumorigenesis by facilitating the G1/S transition and through its transcription regulation of the CCND1 gene in breast cancer cells. In addition, we identified β-catenin as the transcription partner for SOX2 and demonstrated that SOX2 andβ-catenin act in synergy in the transcription regulation of CCND1 in breast cancer cells. Our experiments not only determined a role for SOX2 in mammary tumorigenesis but also revealed another activity of the multifunctional protein, β-catenin. The SOX 2The abbreviations used are: SOX, Sry-type HMG box; HMG, high-mobility group; ChIP, chromatin immunoprecipitation; IHC, immunohistochemistry; DCIS, ductal carcinoma in situ; MOI, multiplicity of infection; GFP, green fluorescent protein; BrdU, bromodeoxyuridine; FACS, fluorescent-activated cell sorting; GST, glutathione S-transferase; RT, reverse transcriptase; siRNA, small interference RNA. 2The abbreviations used are: SOX, Sry-type HMG box; HMG, high-mobility group; ChIP, chromatin immunoprecipitation; IHC, immunohistochemistry; DCIS, ductal carcinoma in situ; MOI, multiplicity of infection; GFP, green fluorescent protein; BrdU, bromodeoxyuridine; FACS, fluorescent-activated cell sorting; GST, glutathione S-transferase; RT, reverse transcriptase; siRNA, small interference RNA. gene family encodes a group of transcription factors that are characterized by a highly conserved high-mobility group (HMG) domain (1Bowles J. Schepers G. Koopman P. Dev. Biol. 2000; 227: 239-255Crossref PubMed Scopus (728) Google Scholar, 2Wilson M. Koopman P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: 441-446Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar, 3Kamachi Y. Uchikawa M. Kondoh H. Trends Genet. 2000; 16: 182-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (520) Google Scholar). These genes are found throughout the animal kingdom, are expressed in a restricted spatial-temporal pattern, and play critical roles in stem cell biology, organogenesis, and animal development (3Kamachi Y. Uchikawa M. Kondoh H. Trends Genet. 2000; 16: 182-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (520) Google Scholar, 4Wegner M. Nucleic Acids Res. 1999; 27: 1409-1420Crossref PubMed Scopus (742) Google Scholar). For example, overexpression of Sox2 in mouse neural stem cells blocks their differentiation, and inhibition of Sox2 in these cells causes their premature exit from the cell cycle and differentiation into neurons(5Graham V. Khudyakov J. Ellis P. Pevny L. Neuron. 2003; 39: 749-765Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (976) Google Scholar). Depletion of Sox2 by RNA interference blocks the proliferation of neural stem-like cells and causes them to differentiate into neurons(6Kondo T. Raff M. Genes. Dev. 2004; 18: 2963-2972Crossref PubMed Scopus (187) Google Scholar). Recently, a number of links have been found between SOX transcription factors and human cancers (7Dong C. Wilhelm D. Koopman P. Cytogenet Genome Res. 2004; 105: 442-447Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar). For instance, SOX2 has been found to be an immunogenic antigen in 41% of small cell lung cancer patients (8Gure A.O. Stockert E. Scanlan M.J. Keresztes R.S. Jager D. Altorki N.K. Old L.J. Chen Y.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 4198-4203Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar) and in 29% of meningioma patients (9Comtesse N. Zippel A. Walle S. Monz D. Backes C. Fischer U. Mayer J. Ludwig N. Hildebrandt A. Keller A. Steudel W.I. Lenhof H.P. Meese E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 9601-9606Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). Immunohistochemistry results suggest that SOX2 is involved in later events of carcinogenesis, such as invasion and metastasis of pancreatic intraepithelial neoplasia (10Sanada Y. Yoshida K. Ohara M. Oeda M. Konishi K. Tsutani Y. Pancreas. 2006; 32: 164-170Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). SOX2 may also be involved in gastric carcinogenesis (11Li X.L. Eishi Y. Bai Y.Q. Sakai H. Akiyama Y. Tani M. Takizawa T. Koike M. Yuasa Y. Int. J. Oncol. 2004; 24: 257-263PubMed Google Scholar) and may be amplified in prostate cancers (12Sattler H.P. Lensch R. Rohde V. Zimmer E. Meese E. Bonkhoff H. Retz M. Zwergel T. Bex A. Stoeckle M. Wullich B. Prostate. 2000; 45: 207-215Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar). Furthermore, SOX2 expression has been observed in 43% of basal cell-like breast carcinomas and was found to be strongly correlated with CK5/6, EGFR, and vimentin immunoreactivity, suggesting that SOX2 may play a role in conferring a less differentiated phenotype in these tumors (13Rodriguez-Pinilla S.M. Sarrio D. Moreno-Bueno G. Rodriguez-Gil Y. Martinez M.A. Hernandez L. Hardisson D. Reis-Filho J.S. Palacios J. Mod. Pathol. 2007; 20: 474-481Crossref PubMed Scopus (187) Google Scholar). How SOX2 exerts its oncogenic potential is currently unknown. SOX proteins including SOX2 bind to specific DNA sequences (C(T/A)TTG(T/A)(T/A)) by means of their HMG domains in functioning as transcription factors to activate or repress target gene expression (2Wilson M. Koopman P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: 441-446Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar, 3Kamachi Y. Uchikawa M. Kondoh H. Trends Genet. 2000; 16: 182-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (520) Google Scholar). It is currently accepted that SOX proteins themselves do not possess sufficient affinities for DNA binding. Rather, the transcription activity of SOX proteins requires recruitment of other protein partners, which facilitate and stabilize the formation of SOX transcription initiation complexes (2Wilson M. Koopman P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: 441-446Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar, 3Kamachi Y. Uchikawa M. Kondoh H. Trends Genet. 2000; 16: 182-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (520) Google Scholar). In fact, the functional specificities among members of the SOX family and the tissue specificity for a particular SOX protein are believed to be determined largely by the differential partnership of SOX proteins with other proteins (2Wilson M. Koopman P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: 441-446Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar, 3Kamachi Y. Uchikawa M. Kondoh H. Trends Genet. 2000; 16: 182-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (520) Google Scholar). Numerous transcription factors from a wide range of families have been found to partner with SOX proteins (2Wilson M. Koopman P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: 441-446Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar, 3Kamachi Y. Uchikawa M. Kondoh H. Trends Genet. 2000; 16: 182-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (520) Google Scholar). As stated above, because the partnership of SOX proteins with different protein factors is a crucial element in determining the functional specificity of SOX proteins, it is of great importance to identify partner proteins for different SOX proteins in different tissues to understand the pathophysiological activities of SOX proteins. Another prominent and related issue is the identification of the downstream targets of SOX proteins. To date, investigation of the functions of SOX proteins has concentrated on embryonic development, and information on the physiological functions of SOX proteins in adult tissues, as well as their potential roles in carcinogenesis, is limited. In this study, we found that SOX2 overexpression is a frequent event in breast carcinomas and that the levels of SOX2 expression were strongly correlated with tumor grades and with the levels of cyclin D1 expression in breast carcinoma samples. We demonstrated that SOX2 promoted the proliferation of breast cancer cells through facilitating the G1/S transition and through up-regulation of the CCND1 gene. Furthermore, we identified β-catenin as the transcription partner for SOX2 in breast cancer cells and demonstrated that SOX2 synergized with β-catenin in transactivation of the CCND1 gene. Tissue Specimens and Cell Lines—Breast carcinoma tissues were obtained from Peking University Oncology Hospital. Samples were frozen in liquid nitrogen immediately after surgical removal and maintained at –80 °C until use. All human tissue was collected using protocols approved by the Ethics Committee of the Peking University Health Science Center. The normal human breast epithelia cell lines and the human breast cancer cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). Recombinant Retroviral Construction—Recombinant Retro-GFP, Retro-SOX2, and Retro-SOX2 RNAi were generated using the BD Retro-X™ Universal Packaging System (BD Biosciences, San Jose, CA) according to the manual provided by the vendor. The cDNA for full-length SOX2 and the specific oligonucleotide for generating SOX2 siRNA were cloned into the pLNCX2 vector. The resultant plasmids were transformed into Escherichia coli DH5α, purified, and co-transfected with the pVSV-G vector into the GP2-293 packaging cell line (BD Biosciences) using Lipofectamine (Invitrogen). Three days after transfection, cell lysates were obtained from the 293 cells. Cell lysates were added to 293 cells again, and when most of the cells had been killed by virus infection and detached, cell lysates were collected and filtered through a 0.45-μm cellulose acetate filter. The viral titers were determined according to the procedure provided by the vendor. For cell infection, cells were incubated with viruses at an MOI (multiplicity of infection) of 10 for 6 h before fresh medium was added, and cultures were continued for another 48 h. For generation of SOX-overexpressing cells to be transplanted into nude mice, infected cells were grown in the presence of 400 μg/ml of G418 for 3 weeks. Individual drug-resistant clones were collected, pooled, and expanded. Tumor Xenografts—MCF-7 breast cancer cells were plated and infected in vitro with mock, Retro-GFP, Retro-SOX2, or Retro-SOX2 RNAi at an MOI of 100. Forty-eight hours after infection, 5 × 106 viable MCF-7 cells in 200 μl of phosphate-buffered saline were injected into the mammary fat pads of 6–8-week-old female BALB/c mice (Charles River, Beijing, China). Six animals per group were used in each experiment. 17β-Estradiol pellets (0.72 mg/pellet, 60 day release; Innovative Research of America, Sarasota, FL) were implanted 1 day before the tumor cell injection. Tumors were measured weekly using a vernier caliper, and volume was calculated according to the formula: π /6 × length × width2. Tumors were collected at the time of sacrifice, 8-weeks postretrovirus infection. Deparaffinized sections of tumor tissue were used to assess proliferation using antibodies against Ki-67 (1:200, Zymed Laboratories). Apoptosis was determined using the In Situ Cell Death Detection kit, POD (Roche Applied Science, Germany), according to the manufacturer's instruction. Nuclei that stained brown were scored as positive for apoptosis and blue as negative. All studies were approved by the Animal Care Committee of Peking University Health Science Center. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assays—ChIP assays were performed essentially as described previously (14Shang Y. Hu X. DiRenzo J. Lazar M.A. Brown M. Cell. 2000; 103: 843-852Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1423) Google Scholar, 15Shang Y. Brown M. Science. 2002; 295: 2465-2468Crossref PubMed Scopus (982) Google Scholar, 16Zhang H. Yi X. Sun X. Yin N. Shi B. Wu H. Wang D. Wu G. Shang Y. Genes Dev. 2004; 18: 1753-1765Crossref PubMed Scopus (82) Google Scholar, 17Wu H. Chen Y. Liang J. Shi B. Wu G. Zhang Y. Wang D. Li R. Yi X. Zhang H. Sun L. Shang Y. Nature. 2005; 438: 981-987Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar, 18Zhang H. Sun L. Liang J. Yu W. Zhang Y. Wang Y. Chen Y. Li R. Sun X. Shang Y. EMBO J. 2006; 25: 4223-4233Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 19Yin N. Wang D. Zhang H. Yi X. Sun X. Shi B. Wu H. Wu G. Wang X. Shang Y. Cancer Res. 2004; 64: 5870-5875Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Primers that specifically amplify the CCND1 promoter were used in the PCR amplifications, as listed: for proximal promoter (spanning –86 to +234 bp) forward: 5′-tgccgggctttgatcttt-3′ and reverse: 5′-cggtcgttgaggaggttgg-3′; for control region (spanning –2598 to –2377 bp) forward: 5′-ttttggattttctttc-3′ and reverse: 5′-gcattttgattttatt-3′. SOX2 Is Overexpressed in Human Mammary Tumors and Its Level Is Correlated with Tumor Grade—Similar to other developmentally regulated genes, the expression of SOX2 is supposed to be switched off in adulthood. The observation that SOX2 is expressed in several types of tumors (7Dong C. Wilhelm D. Koopman P. Cytogenet Genome Res. 2004; 105: 442-447Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 8Gure A.O. Stockert E. Scanlan M.J. Keresztes R.S. Jager D. Altorki N.K. Old L.J. Chen Y.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 4198-4203Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar, 9Comtesse N. Zippel A. Walle S. Monz D. Backes C. Fischer U. Mayer J. Ludwig N. Hildebrandt A. Keller A. Steudel W.I. Lenhof H.P. Meese E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 9601-9606Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar, 10Sanada Y. Yoshida K. Ohara M. Oeda M. Konishi K. Tsutani Y. Pancreas. 2006; 32: 164-170Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar, 11Li X.L. Eishi Y. Bai Y.Q. Sakai H. Akiyama Y. Tani M. Takizawa T. Koike M. Yuasa Y. Int. J. Oncol. 2004; 24: 257-263PubMed Google Scholar, 12Sattler H.P. Lensch R. Rohde V. Zimmer E. Meese E. Bonkhoff H. Retz M. Zwergel T. Bex A. Stoeckle M. Wullich B. Prostate. 2000; 45: 207-215Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 13Rodriguez-Pinilla S.M. Sarrio D. Moreno-Bueno G. Rodriguez-Gil Y. Martinez M.A. Hernandez L. Hardisson D. Reis-Filho J.S. Palacios J. Mod. Pathol. 2007; 20: 474-481Crossref PubMed Scopus (187) Google Scholar) prompted us to investigate whether SOX2 was also expressed in breast cancers. Using immunohistochemistry (IHC), we screened paraffin-embedded mammary tissue sections from 19 normal and 56 breast cancer patients for the expression of SOX2. The results of these experiments indicated that, while normal mammary epithelial cells displayed none or weak SOX2 staining (Fig. 1A, left panel), breast carcinoma cells were strongly positive for SOX2 staining in the nucleus (Fig. 1A, right panel). To investigate whether there is any association between the expression level of SOX2 and the development and progression of breast tumors, quantitative real-time RT-PCR analysis of primary tumor mRNAs was carried out to determine the relative expression levels of SOX2. We defined the overexpression cut-off value for tumors to be the normalized mean expression of SOX2 in normal tissue plus three times the standard deviation (20Wulf G.M. Ryo A. Wulf G.G. Lee S.W. Niu T. Petkova V. Lu K.P. EMBO J. 2001; 20: 3459-3472Crossref PubMed Scopus (475) Google Scholar). In 19 normal and 56 primary human breast cancer tissues that we examined, we observed a striking difference in the level of SOX2 expression. According to Bloom and Richardson's classification system (21Bloom H.J. Richardson W.W. Br. J. Cancer. 1957; 11: 359-377Crossref PubMed Scopus (2613) Google Scholar), SOX2 overexpression was observed in 33.3% (3 of 9) of ductal carcinoma in situ (DCIS) tumors, 42.3% (11 out of 26) of grade II tumors, and 57.1% (12 of 21) of grade III tumors (Fig. 1B). Moreover, Western blotting analysis of immunoreactive SOX2 in established mammary epithelial cell lines indicated that the levels of SOX2 in breast cancer cell lines were considerably higher than those in the two cell lines (MCF-10A, HBL100) derived from normal mammary epithelial cells (Fig. 1C). Collectively, these data suggest that the overexpression of SOX2 might be a frequent event in human breast cancer and that the level of SOX2 expression is correlated with the tumor grade. SOX2 Promotes Proliferation and Tumorigenesis of Breast Cancer Cells—Because of the crucial role of SOX2 in cell proliferation and differentiation, the deregulation of SOX2 expression in breast carcinomas and breast cell lines may have important pathological relevance. Thus, we next investigate the role of SOX2 expression in cell proliferation and tumorigenesis. First, both gain-of-function and loss-of-function experiments were performed to examine the effect of SOX2 overexpression or knockdown on cell cycle regulation in mammary carcinoma cells. In these experiments, MCF-7 cells were synchronized at the G0/G1 phases by serum starvation (22Shi B. Liang J. Yang X. Wang Y. Zhao Y. Wu H. Sun L. Zhang Y. Chen Y. Li R. Hong M. Shang Y. Mol. Cell. Biol. 2007; 27: 5105-5119Crossref PubMed Scopus (257) Google Scholar, 23Zhang Y. Zhang H. Liang J. Yu W. Shang Y. EMBO J. 2007; 26: 2645-2657Crossref PubMed Scopus (40) Google Scholar, 24Shang Y. Nat. Rev. Cancer. 2006; 6: 360-368Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar), at the G1/S boundary by double thymidine blocking (25Wang S.C. Nakajima Y. Yu Y.L. Xia W. Chen C.T. Yang C.C. McIntush E.W. Li L.Y. Hawke D.H. Kobayashi R. Hung M.C. Nat. Cell Biol. 2006; 8: 1359-1368Crossref PubMed Scopus (244) Google Scholar), or at mitosis (M phase) with nocodazole blocking (26Shifrin V.I. Davis R.J. Neel B.G. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2957-2962Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (43) Google Scholar). Cell cycle profiling by FACS indicated that, after release from thymidine and nocodazole blocking, cells with either SOX2 overexpression or with SOX2 knockdown proceeded through the S and G2 phases with efficiencies and kinetics similar to those of control cells (Fig. 2A, upper panel). However, after release of the cells from G0/G1 arrest, overexpression of SOX2 was associated with an increase in the population of cells in the S+G2/M phases and a concomitant decrease in the population of cells in the G0/G1 phases (Fig. 2A, upper panel). Consistently, knockdown of the expression of SOX2 with siRNA resulted in an accumulation of cells in the G0/G1 phases. Similar results were also observed in one of basal-like breast cancer cell lines, MDA-MB-231 (data not shown). To confirm that the phenotypic behavior of cells with SOX2 knockdown was specifically caused by loss of SOX2 protein, we sought to “rescue” the effect of the SOX2 RNAi by constitutively expressing murine Sox2 in MCF-7 cells. As shown in Fig. 2A (lower panel), the expression of Sox2 in cells with SOX2 knockdown resulted in an increase in the population of cells in the S+G2/M phases, similar to the profile of the cells co-transfected with a combination of Sox2 and nonspecific siRNA, suggesting that the G0/G1 accumulation of cells with SOX2 knockdown was specifically associated with the loss of SOX2 protein. Collectively, these results indicate that SOX2 promotes the proliferation of breast cancer cells by facilitating the G1/S transition. To investigate the role of SOX2 in breast tumorigenesis, retrovirus (retro)-mediated overexpression and knockdown strategy was utilized. Retro-EGFP (retroviruses carrying the EGFP gene), Retro-SOX2 (retroviruses carrying the SOX2 gene), or Retro-SOX2-RNAi (retroviruses carrying an oligonucleotide specific for SOX2 mRNA) were constructed and used to infect MCF-7 cells. Anchorage-independent growth assays demonstrated that SOX2-overexpressing cells exhibited an increase both in the size and number of colonies formed on the soft agar, whereas knockdown of SOX2 expression resulted in a substantial reduction in the number of colony formed (Fig. 2B). The level of SOX2 expression in MCF-7 cells infected with Retro-EGFP, Retro-SOX2, or Retro-SOX2-RNAi was monitored by Western blotting (Fig. 2B, right panel). To assess the role of SOX2 on breast tumorigenesis in vivo, equal numbers of mock-, Retro-EGFP, Retro-SOX2, or Retro-SOX2-siRNA-infected MCF-7 cells were implanted onto the mammary fat pad of athymic BALB/c mice, and the growth of the implanted tumors was measured. The results of these experiments indicated that overexpression of SOX2 was associated with a significant tumor growth over an 8-week period, and knockdown of SOX2 expression resulted in a dramatic reduction in tumor volume (Fig. 2C). The increase/decrease in tumor volume could either be a reflection of enhanced/inhibited cell proliferation or a manifestation of inhibited/enhanced apoptosis. To further elucidate the mechanism by which SOX2 promotes mammary tumor growth, serial xenograft tumor sections were stained with Ki-67 and TUNEL, markers for cellular proliferation and apoptosis, respectively. As shown in Fig. 2D (upper panel), compared with the control, tumors with SOX2 overexpression showed more Ki-67-positive nuclei, whereas tumors with SOX2 knockdown exhibited significantly fewer Ki-67-positive nuclei. However, the apoptosis assay revealed no statistically significant difference in the percentage of TUNEL-positive cells between the control and experimental groups (Fig. 2D, lower panel), suggesting that SOX2 was able to promote cell proliferation and tumorigenesis in xenograft models. Taken together, these experiments indicate that SOX2 contributed to breast cancer cell proliferation and tumorigenic properties both in vitro and in vivo. Molecular Profiling of SOX2 Downstream Targets in Breast Cancer Cells—As stated before, SOX2 is a transcription factor that exerts its biological function through transactivation of its downstream target genes (2Wilson M. Koopman P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: 441-446Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar, 3Kamachi Y. Uchikawa M. Kondoh H. Trends Genet. 2000; 16: 182-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (520) Google Scholar). To further delineate the molecular mechanism underlying the cell proliferation and tumorigenic properties of SOX2, we investigated the gene expression profile in SOX2-overexpressing MCF-7 cells using Human Genome U133 Plus 2.0 Affymetrix Gene Chip. The microarray analysis identified 145 up-regulated genes and 41 down-regulated genes. The data were analyzed, and genes were classified into cellular signaling pathways that are known to be implicated in cell proliferation and differentiation with the Gene Ontology classification system using DAVID software (supplemental Fig. S1A). These alleles were all up-regulated by SOX2. The microarray results were validated by quantitative RT-PCR analysis of 7 genes selected to represent different levels of induction, including 4 up-regulated genes (CCND1, FGFR2, SMARCA1, and CXCL10) and 3 down-regulated genes (CSTA, MME, and ZNF407) (supplemental Fig. S1B). Identification of Cyclin D1 as a Downstream Target for SOX2—Among these SOX2-regulated genes, 4(FGFR2, RhoB, CCND1, and RET), all of which were up-regulated by SOX2, are reported to be related to cell growth and proliferation. To further dissect the signaling pathway leading to SOX2-mediated cell proliferation and tumorigenesis, gain-of-function and loss-of-function experiments were performed in MCF-7 cells in which the expression of SOX2 was silenced while the 4 genes were ectopically individually expressed (gain-of-function) or where SOX2 was overexpressed while the expression of the 4 genes was individually silenced (loss-of-function). The proliferation of MCF-7 cells under these experimental conditions was measured by BrdU incorporation assays. As shown in Fig. 3A, both the gain-of-function and loss-of-function experiments revealed that, while FGFR2, RHOB, and RET had marginal effects on SOX2-promoted cell proliferation, the most profound effect was found with CCND1, indicating that CCND1 is an important downstream target in mediating the cell proliferation activity of SOX2. The expression of the proteins was monitored by Western blotting (Fig. 3B). Similar results were also observed in one of basal-like breast cancer cell lines, MDA-MB-231 (data not shown). Next we investigated the regulation of endogenous cyclin D1 protein expression by SOX2 in MCF-7 cells. As shown in Fig. 3C, while either overexpression or knockdown of SOX2 had little effect on the expression of other cell cycle-regulated genes including cyclin D3, cyclin E, p21Cip1, and p27Kip1, the expression of cyclin D1 protein was elevated in cells overexpressing SOX2 and inhibited in cells with SOX2 knockdown. These results further support the argument that CCND1 gene is a downstream target for SOX2 in breast cancer cells. To further explore the role of cyclin D1 in mediating SOX2-promoted proliferation of breast cancer cells, we tested whether overexpression of cyclin D1 could alleviate the effect of G0/G1 accumulation under SOX2 knockdown. For this purpose, MCF-7 cells were co-transfected with SOX2 siRNA and cyclin D1 expression construct or with SOX2 siRNA plus an empty vector as control. FACS analysis revealed that cyclin D1 transfection in cells with SOX2 knockdown resulted in a significant increase in the percentage of cells in the S+G2/M phases (Fig. 4A, upper panel). On the other hand, even with SOX2 overexpression, knockdown of cyclin D1 expression was associated with a failure in the G1/S transition in MCF-7 cells (Fig. 4A, lower panel). The expression of SOX2, cyclin D1, and other cell cycle-related genes under different experimental conditions is shown in Fig. 4B. These results strongly favor the idea that cyclin D1 is a critical downstream mediator of SOX2 in promoting the G1/S transition and cell proliferation. Correlation of SOX2 and Cyclin D1 Expression in Breast Tumor Samples—As stated before, SOX2 is up-regulated in several types of cancers including pancreatic intraepithelial neoplasia, prostate cancer, gastric carcinoma, and breast cancer (7Dong C. Wilhelm D. Koopman P. Cytogenet Genome Res. 2004; 105: 442-447Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 8Gure A.O. Stockert E. Scanlan M.J. Keresztes R.S. Jager D. Altorki N.K. Old L.J. Chen Y.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 4198-4203Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar, 9Comtesse N. Zippel A. Walle S. Monz D. Backes C. Fischer U. Mayer J. Ludwig N. Hildebrandt A. Keller A. Steudel W.I. Lenhof H.P. Meese E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 9601-9606Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar, 10Sanada Y. Yoshida K. Ohara M. Oeda M. Konishi K. Tsutani Y. Pancreas. 2006; 32: 164-170Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar, 11Li X.L. Eishi Y. Bai Y.Q. Sakai H. Akiyama Y. Tani M. Takizawa T. Koike M. Yuasa Y. Int. J. Oncol. 2004; 24: 257-263PubMed Google Scholar, 12Sattler H.P. Lensch R. Rohde V. Zimmer E. Meese E. Bonkhoff H. Retz M. Zwergel T. Bex A. Stoeckle M. Wullich B. Prostate. 2000; 45: 207-215Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 13Rodriguez-Pinilla S.M. Sarrio D. Moreno-Bueno G. Rodriguez-Gil Y. Martinez M.A. Hernandez L. Hardisson D. Reis-Filho J.S. Palacios J. Mod. Pathol. 2007; 20: 474-481Crossref PubMed Scopus (187) Google Scholar). Analogously, CCND1 amplification/overexpression has been documented in ∼50% of breast carcinomas (27Arnold A. Papanikolaou A. J. Clin. Oncol. 2005; 23: 4215-4224Crossref PubMed Scopus (317) Google Scholar, 28Bartkova J. Lukas J. Muller H. Lutzhoft D. Strauss M. Bartek J. Int. J. Cancer. 1994; 57: 353-361Crossref PubMed Scopus (471) Google Scholar, 29Gillett C. Fantl V. Smith R. Fisher C. Bartek J. Dickson C. Barnes D. Peters G. Cancer Res. 1994; 54: 1812-1817PubMed Google Scholar). In light of our observation that SOX2 is capable of upregulating CCND1 expression, it was logical to postulate that the expression of SOX2 is correlated with the expression of CCND1 in primary breast carcinomas. To validate this hypothesis, the expression of CCND1 and SOX2 mRNAs was analyzed by real time RT-PCR in mammary tissues. As shown in Fig. 4C, statistical analysis found a Spearman correlation coefficient of 0.725 (p < 0.0001) between the expression of CCND1 and SOX2 mRNAs in the 26 breast carcinoma samples tested, whereas there was no correlation between CCND1 and SOX2 mRNA expression in 19 normal mammary tissue samples. These experiments further substantiate a functional link between SOX2 and cyclin D1 in brea

Essential for embryonic development, the polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) is overexpressed in breast and prostate cancers and is implicated in the growth and aggression of the tumors. The tumorigenic mechanism underlying EZH2 overexpression is largely unknown. It is believed that EZH2 exerts its biological activity as a transcription repressor. However, we report here that EZH2 functions in gene transcriptional activation in breast cancer cells. We show that EZH2 transactivates genes that are commonly targeted by estrogen and Wnt signaling pathways. We demonstrated that EZH2 physically interacts directly with estrogen receptor α and β-catenin, thus connecting the estrogen and Wnt signaling circuitries, functionally enhances gene transactivation by estrogen and Wnt pathways, and phenotypically promotes cell cycle progression. In addition, we identified the transactivation activity of EZH2 in its two N-terminal domains and demonstrated that these structures serve as platforms to connect transcription factors and the Mediator complex. Our experiments indicated that EZH2 is a dual function transcription regulator with a dynamic activity, and we provide a mechanism for EZH2 in tumorigenesis.

Abstract Although SIRT7 is a member of sirtuin family proteins that are described as NAD + -dependent class III histone deacetylases, the intrinsic enzymatic activity of this sirtuin protein remains to be investigated and the cellular function of SIRT7 remains to be explored. Here we report that SIRT7 is an NAD + -dependent histone desuccinylase. We show that SIRT7 is recruited to DNA double-strand breaks (DSBs) in a PARP1-dependent manner and catalyses desuccinylation of H3K122 therein, thereby promoting chromatin condensation and DSB repair. We demonstrate that depletion of SIRT7 impairs chromatin compaction during DNA-damage response and sensitizes cells to genotoxic stresses. Our study indicates SIRT7 is a histone desuccinylase, providing a molecular basis for the understanding of epigenetic regulation by this sirtuin protein. Our experiments reveal that SIRT7-catalysed H3K122 desuccinylation is critically implemented in DNA-damage response and cell survival, providing a mechanistic insight into the cellular function of SIRT7.

It is well-documented that the methylation of histone H3 lysine 4 (H3K4) and of H3K9 are mutually exclusive, an epigenetic phenomenon conserved from yeast to humans. How this opposed methylation modification is accomplished and coordinated in mammalian cells is poorly understood. Here we report that the H3K9 trimethyl demethylase JMJD2B is an integral component of the H3K4-specific methyltransferase, the mixed-lineage leukemia (MLL) 2 complex. We show that the JMJD2B/MLL2 complex is copurified with estrogen receptor α (ERα) and is required for ERα-regulated transcription. We demonstrate that H3K9 demethylation and H3K4 methylation are coordinated in ERα-activated transcription such that H3K9 demethylation is a prerequisite for H3K4 methylation. Significantly, depletion of JMJD2B impairs the estrogen-induced G 1 /S transition of the cell cycle in vitro and inhibits breast tumorigenesis in vivo. Interestingly, JMJD2B itself is an ERα target gene, and forms a feed-forward regulatory loop in regulation of the hormone response. Our results provide a molecular basis for the coordinated H3K4 methylation/H3K9 demethylation in transcription activation, link the trimethyl demethylase JMJD2B to euchromatin functions, and provide a mechanism for JMJD2B in breast carcinogenesis.