SummaryRecently, we showed that homozygosity for the common 677(C→T) mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, causing thermolability of the enzyme, is a risk factor for neural-tube defects (NTDs). We now report on another mutation in the same gene, the 1298(A→C) mutation, which changes a glutamate into an alanine residue. This mutation destroys an MboII recognition site and has an allele frequency of .33. This 1298(A→C) mutation results in decreased MTHFR activity (one-way analysis of variance [ANOVA] P<.0001), which is more pronounced in the homozygous than heterozygous state. Neither the homozygous nor the heterozygous state is associated with higher plasma homocysteine (Hcy) or a lower plasma folate concentration—phenomena that are evident with homozygosity for the 677(C→T) mutation. However, there appears to be an interaction between these two common mutations. When compared with heterozygosity for either the 677(C→T) or 1298(A→C) mutations, the combined heterozygosity for the 1298(A→C) and 677(C→T) mutations was associated with reduced MTHFR specific activity (ANOVA P <.0001), higher Hcy, and decreased plasma folate levels (ANOVA P<.03). Thus, combined heterozygosity for both MTHFR mutations results in similar features as observed in homozygotes for the 677(C→T) mutation. This combined heterozygosity was observed in 28% (n = 86) of the NTD patients compared with 20% (n = 403) among controls, resulting in an odds ratio of 2.04 (95% confidence interval: .9–4.7). These data suggest that the combined heterozygosity for the two MTHFR common mutations accounts for a proportion of folate-related NTDs, which is not explained by homozygosity for the 677(C→T) mutation, and can be an additional genetic risk factor for NTDs. Recently, we showed that homozygosity for the common 677(C→T) mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, causing thermolability of the enzyme, is a risk factor for neural-tube defects (NTDs). We now report on another mutation in the same gene, the 1298(A→C) mutation, which changes a glutamate into an alanine residue. This mutation destroys an MboII recognition site and has an allele frequency of .33. This 1298(A→C) mutation results in decreased MTHFR activity (one-way analysis of variance [ANOVA] P<.0001), which is more pronounced in the homozygous than heterozygous state. Neither the homozygous nor the heterozygous state is associated with higher plasma homocysteine (Hcy) or a lower plasma folate concentration—phenomena that are evident with homozygosity for the 677(C→T) mutation. However, there appears to be an interaction between these two common mutations. When compared with heterozygosity for either the 677(C→T) or 1298(A→C) mutations, the combined heterozygosity for the 1298(A→C) and 677(C→T) mutations was associated with reduced MTHFR specific activity (ANOVA P <.0001), higher Hcy, and decreased plasma folate levels (ANOVA P<.03). Thus, combined heterozygosity for both MTHFR mutations results in similar features as observed in homozygotes for the 677(C→T) mutation. This combined heterozygosity was observed in 28% (n = 86) of the NTD patients compared with 20% (n = 403) among controls, resulting in an odds ratio of 2.04 (95% confidence interval: .9–4.7). These data suggest that the combined heterozygosity for the two MTHFR common mutations accounts for a proportion of folate-related NTDs, which is not explained by homozygosity for the 677(C→T) mutation, and can be an additional genetic risk factor for NTDs.

Background Muscle biopsy is the gold standard for diagnosis of mitochondrial disorders because of the lack of sensitive biomarkers in serum. Fibroblast growth factor 21 (FGF-21) is a growth factor with regulatory roles in lipid metabolism and the starvation response, and concentrations are raised in skeletal muscle and serum in mice with mitochondrial respiratory chain deficiencies. We investigated in a retrospective diagnostic study whether FGF-21 could be a biomarker for human mitochondrial disorders. Methods We assessed samples from adults and children with mitochondrial disorders or non-mitochondrial neurological disorders (disease controls) from seven study centres in Europe and the USA, and recruited healthy volunteers (healthy controls), matched for age where possible, from the same centres. We used ELISA to measure FGF-21 concentrations in serum or plasma samples (abnormal values were defined as >200 pg/mL). We compared these concentrations with values for lactate, pyruvate, lactate-to-pyruvate ratio, and creatine kinase in serum or plasma and calculated sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values for all biomarkers. Findings We analysed serum or plasma from 67 patients (41 adults and 26 children) with mitochondrial disorders, 34 disease controls (22 adults and 12 children), and 74 healthy controls. Mean FGF-21 concentrations in serum were 820 (SD 1151) pg/mL in adult and 1983 (1550) pg/mL in child patients with respiratory chain deficiencies and 76 (58) pg/mL in healthy controls. FGF-21 concentrations were high in patients with mitochondrial disorders affecting skeletal muscle but not in disease controls, including those with dystrophies. In patients with abnormal FGF-21 concentrations in serum, the odds ratio of having a muscle-manifesting mitochondrial disease was 132·0 (95% CI 38·7–450·3). For the identification of muscle-manifesting mitochondrial disease, the sensitivity was 92·3% (95% CI 81·5–97·9%) and specificity was 91·7% (84·8–96·1%). The positive and negative predictive values for FGF-21 were 84·2% (95% CI 72·1–92·5%) and 96·1 (90·4–98·9%). The accuracy of FGF-21 to correctly identify muscle-manifesting respiratory chain disorders was better than that for all conventional biomarkers. The area under the receiver-operating-characteristic curve for FGF-21 was 0·95; by comparison, the values for other biomarkers were 0·83 lactate (p=0·037, 0·83 for pyruvate (p=0·015), 0·72 for the lactate-to-pyruvate ratio (p=0·0002), and 0·77 for creatine kinase (p=0·013). Interpretation Measurement of FGF-21 concentrations in serum identified primary muscle-manifesting respiratory chain deficiencies in adults and children and might be feasible as a first-line diagnostic test for these disorders to reduce the need for muscle biopsy. Funding Sigrid Jusélius Foundation, Jane and Aatos Erkko Foundation, Molecular Medicine Institute of Finland, University of Helsinki, Helsinki University Central Hospital, Academy of Finland, Novo Nordisk, Arvo and Lea Ylppö Foundation.

A reliable and sensitive complex I assay is an essential tool for the diagnosis of mitochondrial disorders, but current spectrophotometric assays suffer from low sensitivity, low specificity, or both. This deficiency is mainly due to the poor solubility of coenzyme-Q analogs and reaction mixture turbidity caused by the relatively high concentrations of tissue extract that are often required to measure complex I.We developed a new spectrophotometric assay to measure complex I in mitochondrial fractions and applied it to muscle and cultured fibroblasts. The method is based on measuring 2,6-dichloroindophenol reduction by electrons accepted from decylubiquinol, reduced after oxidation of NADH by complex I. The assay thus is designed to avoid nonspecific NADH oxidation because electrons produced in these reactions are not accepted by decylubiquinone, resulting in high rotenone sensitivity.The assay was linear with time and amount of mitochondria. The K(m) values for NADH and 2,6-dichloroindophenol in muscle mitochondria were 0.04 and 0.017 mmol/L, respectively. The highest complex I activities were measured with 0.07 mmol/L decylubiquinone and 3.5 g/L bovine serum albumin. The latter was an essential component of the reaction mixture, increasing the solubility of decylubiquinone and rotenone. In patients with previously diagnosed complex I deficiencies, the new assay detected the complex I deficiencies in both muscle and fibroblasts.This spectrophotometric assay is reproducible, sensitive, and specific for complex I activity because of its high rotenone sensitivity, and it can be applied successfully to the diagnosis of complex I deficiencies.

There are marked mitochondrial abnormalities in parkin-knock-out Drosophila and other model systems. The aim of our study was to determine mitochondrial function and morphology in parkin-mutant patients. We also investigated whether pharmacological rescue of impaired mitochondrial function may be possible in parkin-mutant human tissue.

The advent of massive parallel sequencing is rapidly changing the strategies employed for the genetic diagnosis and research of rare diseases that involve a large number of genes. So far it is not clear whether these approaches perform significantly better than conventional single gene testing as requested by clinicians. The current yield of this traditional diagnostic approach depends on a complex of factors that include gene-specific phenotype traits, and the relative frequency of the involvement of specific genes. To gauge the impact of the paradigm shift that is occurring in molecular diagnostics, we assessed traditional Sanger-based sequencing (in 2011) and exome sequencing followed by targeted bioinformatics analysis (in 2012) for five different conditions that are highly heterogeneous, and for which our center provides molecular diagnosis. We find that exome sequencing has a much higher diagnostic yield than Sanger sequencing for deafness, blindness, mitochondrial disease, and movement disorders. For microsatellite-stable colorectal cancer, this was low under both strategies. Even if all genes that could have been ordered by physicians had been tested, the larger number of genes captured by the exome would still have led to a clearly superior diagnostic yield at a fraction of the cost.

To validate new mitochondrial myopathy serum biomarkers for diagnostic use.We analyzed serum FGF21 (S-FGF21) and GDF15 from patients with (1) mitochondrial diseases and (2) nonmitochondrial disorders partially overlapping with mitochondrial disorder phenotypes. We (3) did a meta-analysis of S-FGF21 in mitochondrial disease and (4) analyzed S-Fgf21 and skeletal muscle Fgf21 expression in 6 mouse models with different muscle-manifesting mitochondrial dysfunctions.We report that S-FGF21 consistently increases in primary mitochondrial myopathy, especially in patients with mitochondrial translation defects or mitochondrial DNA (mtDNA) deletions (675 and 347 pg/mL, respectively; controls: 66 pg/mL, p < 0.0001 for both). This is corroborated in mice (mtDNA deletions 1,163 vs 379 pg/mL, p < 0.0001). However, patients and mice with structural respiratory chain subunit or assembly factor defects showed low induction (human 335 pg/mL, p < 0.05; mice 335 pg/mL, not significant). Overall specificities of FGF21 and GDF15 to find patients with mitochondrial myopathy were 89.3% vs 86.4%, and sensitivities 67.3% and 76.0%, respectively. However, GDF15 was increased also in a wide range of nonmitochondrial conditions.S-FGF21 is a specific biomarker for muscle-manifesting defects of mitochondrial translation, including mitochondrial transfer-RNA mutations and primary and secondary mtDNA deletions, the most common causes of mitochondrial disease. However, normal S-FGF21 does not exclude structural respiratory chain complex or assembly factor defects, important to acknowledge in diagnostics.This study provides Class III evidence that elevated S-FGF21 accurately distinguishes patients with mitochondrial myopathies from patients with other conditions, and FGF21 and GDF15 mitochondrial myopathy from other myopathies.

Abstract Background Mutations in parkin are the most common cause of early onset Parkinson’s disease. Parkin is an E3 ubiquitin ligase, functioning in mitophagy. Mitochondrial abnormalities are present in parkin mutant models. Patient derived neurons are a promising model in which to study pathogenic mechanisms and therapeutic targets. Here we generate induced neuronal progenitor cells from parkin mutant patient fibroblasts with a high dopaminergic neuron yield. We reveal changing mitochondrial phenotypes as neurons undergo a metabolic switch during differentiation. Methods Fibroblasts from 4 controls and 4 parkin mutant patients were transformed into induced neuronal progenitor cells and subsequently differentiated into dopaminergic neurons. Mitochondrial morphology, function and mitophagy were evaluated using live cell fluorescent imaging, cellular ATP and reactive oxygen species production quantification. Results Direct conversion of control and parkin mutant patient fibroblasts results in induced neuronal progenitor and their differentiation yields high percentage of dopaminergic neurons. We were able to observe changing mitochondrial phenotypes as neurons undergo a metabolic switch during differentiation. Our results show that when pre-neurons are glycolytic early in differentiation mitophagy is unimpaired by PRKN deficiency. However as neurons become oxidative phosphorylation dependent, mitophagy is severely impaired in the PRKN mutant patient neurons. These changes correlate with changes in mitochondrial function and morphology; resulting in lower neuron yield and altered neuronal morphology. Conclusions Induced neuronal progenitor cell conversion can produce a high yield of dopaminergic neurons. The mitochondrial phenotype, including mitophagy status, is highly dependent on the metabolic status of the cell. Only when neurons are oxidative phosphorylation reliant the extent of mitochondrial abnormalities are identified. These data provide insight into cell specific effects of PRKN mutations, in particular in relation to mitophagy dependent disease phenotypes and provide avenues for alternative therapeutic approaches.