Abstract Human leukocyte antigen loss of heterozygosity (HLA LOH) allows cancer cells to escape immune recognition by deleting HLA alleles, causing the suppressed presentation of tumor neoantigens that would otherwise bind to them. Despite its importance in immunotherapy response, few methods exist to detect HLA LOH, and their accuracy is not well understood. Here, we develop DASH ( D eletion of A llele- S pecific H LAs), a novel machine learning-based algorithm to detect HLA LOH from paired tumor-normal sequencing data. Through validation with cell line mixtures and patient-specific digital PCR, we demonstrate increased sensitivity compared to previously published tools and pave the way for clinical utility. Using DASH on 611 patients across 15 tumor types, we found that 18% of patients had HLA LOH. Moreover, we show inflated HLA LOH rates compared to genome-wide LOH and correlations between CD274 (PD-L1) expression and MSI status, suggesting the HLA LOH is a key immune resistance strategy.

Abstract Major histocompatibility complex (MHC)-bound peptides that originate from tumor-specific genetic alterations, known as neoantigens, are an important class of anti-cancer therapeutic targets. Accurately predicting peptide presentation by MHC complexes is a key aspect of discovering therapeutically relevant neoantigens. Technological improvements in mass-spectrometry-based immunopeptidomics and advanced modeling techniques have vastly improved MHC presentation prediction over the past two decades. However, improvement in the sensitivity and specificity of prediction algorithms is needed for clinical applications such as the development of personalized cancer vaccines, the discovery of biomarkers for response to checkpoint blockade and the quantification of autoimmune risk in gene therapies. Toward this end, we generated allele-specific immunopeptidomics data using 25 mono-allelic cell lines and created Systematic HLA Epitope Ranking Pan Algorithm (SHERPA™), a pan-allelic MHC-peptide algorithm for predicting MHC-peptide binding and presentation. In contrast to previously published large-scale mono-allelic data, we used an HLA-null K562 parental cell line and a stable transfection of HLA alleles to better emulate native presentation. Our dataset includes five previously unprofiled alleles that expand MHC binding pocket diversity in the training data and extend allelic coverage in underprofiled populations. To improve generalizability, SHERPA systematically integrates 128 mono-allelic and 384 multi-allelic samples with publicly available immunoproteomics data and binding assay data. Using this dataset, we developed two features that empirically estimate the propensities of genes and specific regions within gene bodies to engender immunopeptides to represent antigen processing. Using a composite model constructed with gradient boosting decision trees, multiallelic deconvolution and 2.15 million peptides encompassing 167 alleles, we achieved a 1.44 fold improvement of positive predictive value compared to existing tools when evaluated on independent mono-allelic datasets and a 1.15 fold improvement when evaluating on tumor samples. With a high degree of accuracy, SHERPA has the potential to enable precision neoantigen discovery for future clinical applications.

Abstract While high circulating tumor DNA (ctDNA) levels are associated with poor survival for multiple cancers, variant-specific differences in the association of ctDNA levels and survival have not been examined. Here we investigate KRAS ctDNA (ctKRAS) variant-specific associations with overall and progression-free survival (OS/PFS) in first-line metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma (mPDAC) for patients receiving chemoimmunotherapy (“PRINCE”, NCT03214250), and an independent cohort receiving standard of care (SOC) chemotherapy. For PRINCE, higher baseline plasma levels are associated with worse OS for ctKRAS G12D (log-rank p = 0.0010) but not G12V (p = 0.7101), even with adjustment for clinical covariates. Early, on-therapy clearance of G12D (p = 0.0002), but not G12V (p = 0.4058), strongly associates with OS for PRINCE. Similar results are obtained for the SOC cohort, and for PFS in both cohorts. These results suggest ctKRAS G12D but not G12V as a promising prognostic biomarker for mPDAC and that G12D clearance could also serve as an early biomarker of response.

1010 Background: Circulating tumor DNA (ctDNA) based detection of Molecular Residual Disease (MRD) in breast cancer patients presents a strategy to identify patients at high risk of relapse, although current assays have limited sensitivity for low level ctDNA detection. In this study we profile early breast cancer patients with an ultra-sensitive, whole genome sequencing-based, tumor-informed ctDNA platform, and correlate the findings with clinical outcomes. Methods: We analysed 598 plasma samples (median 8 samples/patient, range 2-14) from 76 patients with early breast cancer (23 TNBC, 33 HER2+, 16 HR+ and 4 unknown) enrolled in the ChemoNEAR study. Samples were collected at diagnosis before therapy, at Cycle 2 of neoadjuvant chemotherapy (NAC), post-surgery after neoadjuvant therapy if administered, and every 3 months during follow-up for the first year, and subsequently every 6 months for up to five years. Plasma cfDNA was analysed using the NeXT Personal ctDNA based MRD platform, a tumour-informed approach leveraging whole-genome sequencing of tumor and normal samples to produce personalised ctDNA sequencing panels, with each bespoke panel consisting of up to ~1,800 selected variants that enable ultra-sensitive MRD detection. MRD detection was correlated with clinical outcomes and histopathological data. Results: We detected a broad range of ctDNA levels ranging from 204,900 PPM to 2.2 PPM (median 296 PPM). 40% of all ctDNA detections were in the ultra-low range of <100 PPM. 97.8% (45/46) of patients had ctDNA detected at baseline prior to treatment, including 100% TNBC, 100% HER2+, and 83% of HR+ patients. At a median follow-up of 76 months (range 5-113) from study entry, detection of ctDNA associated with high risk of future relapse (HR undefined, p<0.0001; log-rank test) and shortened overall survival (p<0.0001; log-rank test) with median lead-time from ctDNA detection to clinical relapse of 12.5 months (range 1-60). MRD was identified in 100% (10/10) of patients who relapsed. Of the relapsed patients, the median level of ctDNA at first MRD detection was 18.5 PPM. No ctDNA undetected patients relapsed throughout follow up (58/58). Three patients had ctDNA detected in follow-up but had not relapsed at the time of data cut off. For patients that were ctDNA undetected at post-surgical landmark, 94% (31/33) patients did not relapse. Conclusions: NeXT Personal detected breast cancer relapse with a long lead-time over clinical relapse, and strongly associated with relapse free survival. The assay demonstrated high rates of ctDNA detection at diagnosis. The strong negative predictive value at landmark suggests potential use in de-escalation studies. Several prospective, interventional trials are being conducted to assess whether treatment based on MRD detection improves outcome.

2510 Background: Determining which patients will achieve clinical benefit from immune checkpoint inhibition (ICI) therapy remains an open question. Liquid biopsy tests to assess baseline and early dynamics of circulating tumor DNA (ctDNA) may allow clinicians to track response more granularly and predict ICI response or resistance prior to imaging. However, lack of sensitivity may hinder accurate detection of low ctDNA levels in tumors with low shedding rates or during substantial drops and clearance in response. Methods: This study represents a cohort of 175 patients with refractory metastatic tumors from 18 different cancer types, who received 1-3 successive lines of ICI treatment in the context of phase-1 clinical trials. Thus far, 609 plasma samples from 90 stage-IV cancer patients receiving immune checkpoint inhibitor (ICI) treatment have been processed. ctDNA was profiled using the NeXT Personal assay, a liquid biopsy platform that leverages whole-genome sequencing of tumor and normal samples to create custom, patient-specific panels that include up to 1,800 somatic variants. This enables the detection of molecular residual disease (MRD) down to a detection threshold of 1 part per million (PPM) of ctDNA. Results: NeXT Personal assay detected positive levels of ctDNA in 99% (81/82) of plasma baseline samples, with a wide dynamic range, extending from 4.2 PPM (~0.00042% TF) to ~640,000 PPM (~64% TF) (median limit of detection = 2 PPM, 0.0002% TF). Lower ctDNA values at baseline were correlated with increased duration of PFS (log-rank p=0.017, HR=0.57, 95% CI 0.36-0.91) and extended OS (log-rank p=0.002, HR=0.46, 95% CI 0.28-0.75). Early reduction in ctDNA level from baseline to treatment cycle 3 was associated with significant increases in PFS (log-rank p=0.001, HR=0.36, 95% CI 0.19-0.67) and OS (log-rank p=0.015, HR=0.44, 95% CI 0.22-0.87), representing a >3-fold increase in both median PFS and OS. ctDNA clearance resulted in significant improvement in both PFS and OS (PFS: log-rank p=0.002, HR=0.24, 95% CI 0.09-0.62; OS: log-rank p=0.01, HR=0.29, 95% CI 0.1-0.8). All plasma timepoints from periods of durable complete response (CR) assessed via RECIST 1.1 were ctDNA-negative, with a molecular clearance lead time of 277 days over radiographically confirmed CR. Conclusions: We demonstrate that early ctDNA dynamics are predictive of long-term ICI response in the advanced, pan-cancer ECT setting. Even in this refractory advanced cancer cohort, an ultra-sensitive assay was required for accurate MRD status determination, with low ctDNA detections down to 4.2 PPM that might otherwise have been missed. Taken together, these findings suggest a high sensitivity ctDNA assay is crucial for accurate monitoring of ICI response, providing information for more accurate patient management.

4025 Background: Metastatic esophagogastric cancer (mEGC) poses a significant challenge due to its poor long-term survival. The KeyLargo trial (NCT03342937) was a single-arm phase II study of pembrolizumab combined with oxaliplatin and capecitabine in first line HER2 negative mEGC patients (pts). Although the study revealed encouraging response rates, not all pts responded, underscoring the need for improved biomarkers. To address this challenge, we utilized an ultra-sensitive tumor-informed circulating tumor DNA (ctDNA) strategy to monitor patient response and identify predictive biomarkers for immune checkpoint blockade (ICB) therapy in mEGC. Methods: Between January 2018 and January 2020, a total of 36 pts were treated. 33 pts were evaluable with an overall response rate of 76%. This included 6 pts with a complete response and 19 pts with a partial response. Our analysis focused on 25 pts with FFPE tumor samples of sufficient quality for whole-genome sequencing (WGS), complemented by >200 corresponding on-treatment plasma samples, collected up to cycle 35. NeXT Personal, a tumor-informed ctDNA assay, was employed to construct bespoke liquid biopsy panels for each patient utilizing single nucleotide variants (SNV) identified through tumor WGS. Each personalized assay comprises up to ~1,800 SNVs, offering enhanced sensitivity for the detection of molecular residual disease (MRD). Results: In the cohort of 25 pts, ctDNA levels were detected across a broad range from 406,067 down to 5.5 parts per million (PPM). All 25 pts (100%) tested positive for MRD at baseline prior to treatment in the study, with a median limit of detection of 2.03 PPM. Molecular progression based on ctDNA increases, consistently preceded imaging progression, with a median lead time of 55 days. Patients exhibiting an early decrease or clearance in ctDNA levels showed significant improvement in overall survival (OS) (p-value=0.002 and 0.005, respectively) and progression-free survival (PFS) (p-value=0.005 and 0.012, respectively). Univariate Cox regression analysis indicated greater risk and a higher hazard ratio (HR) for pts when ctDNA did not significantly decrease (HR=15 for PFS and HR=6.6 for OS) and a protective effect when ctDNA was cleared (HR=0.52 for PFS and HR=0.15 for OS). ctDNA dynamics were highly correlated with changes in the sum of the diameters across all target lesions (rho=0.54, p-value = 7.2e -8 ). Conclusions: ctDNA was detected in all pts at baseline. A decrease in ctDNA levels prior to the first restaging or ctDNA clearance up to cycle 7 were strong predictors of improved patient outcomes. ctDNA-based molecular progression predated progression by imaging by nearly two months, and ctDNA dynamics correlated with changes in tumor diameter. These results are suggestive that an ultra-sensitive liquid biopsy platform could improve treatment decision-making for pts receiving ICB.

e15625 Background: Detection of molecular residual disease (MRD) with ctDNA is highly prognostic for recurrence in CRC. However, many cancers still recur without detectable ctDNA and increased lead time before clinical recurrence may create a window of opportunity to intervene. Here we apply an ultra-sensitive assay, NeXT Personal, to profile patients in the VICTORI study, a prospective cohort of patients with CRC managed with curative-intent treatment. Methods: To date, the first 33 patients with CRC have undergone panel creation. NeXT Personal was employed to construct personalized liquid biopsy panels for each patient with up to ~1,800 single nucleotide variants (SNV) identified via whole-genome sequencing. For each patient, plasma is collected before curative intervention (baseline), every 2 weeks for 2 months (MRD window), and every 3 months for up to 3 years (surveillance). VICTORI will enroll > 175 patients and include a health economics analysis. Results: Of 33 patients enrolled to date, 25 (76%) are stage I-III and 8 are stage IV treated with curative interventions. 18 colon cancers and 15 rectal cancers are included. Pre-operative baseline sensitivity was 90.6% (29/32; 1 patient excluded as pCR at the time of baseline blood draw). Of the MRD- patients at baseline, 2 had prior neoadjuvant treatment and 1 was stage 1. Preliminary results (median 7.2 month follow-up; 5 recurrences) show 80% (4/5) of recurrences are MRD+ at the 4-week landmark and 50% (2/4; 1 missing sample) were MRD+ at the 2-week landmark. In 75% (3/4) stage II-III recurrences, the first MRD+ detection was in the ultra-low range of < 100 PPM ( < 0.01% tumor fraction). MRD detection at week 4 and 8 trended towards poorer recurrence-free survival (RFS) with similar separation of patients (log rank p = 0.062 and p = 0.011, respectively). Conclusions: Preliminary results from our prospective study demonstrate strong rates of ctDNA detection at week 4 landmark analysis, potentially due to detection of very low levels of ctDNA with an ultra-sensitive MRD assay. The majority of the first detections for MRD were in the ultra-low ctDNA range, indicating the importance of high sensitivity MRD testing. [Table: see text]

588 Background: Neoadjuvant THP may become a new standard for pts with early stage HER2+ BC pending results of large ongoing trials. Although ctDNA persistence in the (neo)adjuvant setting is associated with elevated risk of distant recurrence, the prevalence and dynamics of ctDNA in HER2+ BC are unknown. Methods: On the single-arm phase II DAPHNe trial, pts with stage II-III HER2+ BC received 12 weeks of neoadjuvant THP, followed by surgery and adjuvant systemic therapy (tx) per physicians’ discretion (with no further chemotherapy in case of pCR). Plasma samples were prospectively collected at 4 timepoints: baseline (BL), pre-operatively (pre-op), immediate post-operatively (post-op), and during the final 3 mos of adjuvant HER2-directed tx. ctDNA was measured using NeXT Personal, a tumor-informed assay based on whole-genome sequencing of tumor/normal samples to detect and quantify minimal residual disease (MRD). We assessed the association of MRD with residual cancer burden (RCB) and long-term outcomes. Results: Of 98 pts enrolled in DAPHNe, 50 had at least one plasma sample sequenced with NeXT Personal. Of these 50 pts, the median age was 50 yrs, 92% had clinical stage II and 64% had hormone-receptor positive (HR+) tumors. RCB scores were: RCB 0 (33/50 pts, 66%), RCB I (2/50 pts, 4%), RCB II (14/50 pts, 28%), RCB III (1/50 pts, 2%). With 50 mos median follow-up, there have been no breast cancer recurrences. ctDNA was detected (ctDNA+) at BL in 42/49 pts (92%) (median detected level 210 parts per million (PPM), broad detection range of 36,978 down to 3 PPM, and 34% of detected pts had ctDNA level <100 PPM). All pts with T3/T4 tumors or positive nodes had BL ctDNA+, whereas 91% and 85% of pts with T1/T2 or node-negative tumors, respectively, had BL ctDNA+. Most pts cleared MRD after THP. Rates of ctDNA detection at post-BL timepoints were: 2/49 pts (4%) at pre-op; 2/48 pts (4%) at post-op; and 1/34 pts (3%) at late adjuvant times. Statistical comparison of pts who cleared vs did not clear ctDNA during neoadjuvant THP was not possible given the high rate of ctDNA positivity at BL and the high rate of negativity pre-op. Clinical vignettes of the 5 pts with detectable MRD at any post-BL timepoint are shown (Table). MRD data from additional pts will be presented. Conclusions: In this population of moderate risk (mostly stage II) HER2+ BC pts, 92% were ctDNA+ at BL. Neoadjuvant THP was very effective at clearing MRD, regardless of whether there was residual disease in the breast/nodes or not, consistent with the absence of any BC recurrence in the cohort to date. Clinical trial information: NCT03716180 . [Table: see text]

Abstract Circulating tumor DNA (ctDNA) detection can predict clinical risk in early-stage tumors. However, clinical applications are constrained by the sensitivity of clinically validated ctDNA detection approaches. NeXT Personal is a whole-genome-based, tumor-informed platform that has been analytically validated for ultrasensitive ctDNA detection at 1–3 ppm of ctDNA with 99.9% specificity. Through an analysis of 171 patients with early-stage lung cancer from the TRACERx study, we detected ctDNA pre-operatively within 81% of patients with lung adenocarcinoma (LUAD), including 53% of those with pathological TNM (pTNM) stage I disease. ctDNA predicted worse clinical outcome, and patients with LUAD with <80 ppm preoperative ctDNA levels (the 95% limit of detection of a ctDNA detection approach previously published in TRACERx) experienced reduced overall survival compared with ctDNA-negative patients with LUAD. Although prospective studies are needed to confirm the clinical utility of the assay, these data show that our approach has the potential to improve disease stratification in early-stage LUADs.