Abstract Regulatory B cells control inflammation and autoimmunity in mice, including the recently identified IL-10–competent B10 cell subset that represents 1% to 3% of spleen B cells. In this study, a comparable IL-10–competent B10 cell subset was characterized in human blood. B10 cells were functionally identified by their ability to express cytoplasmic IL-10 after 5 hours of ex vivo stimulation, whereas progenitor B10 (B10pro) cells required 48 hours of in vitro stimulation before they acquired the ability to express IL-10. B10 and B10pro cells represented 0.6% and approximately 5% of blood B cells, respectively. Ex vivo B10 and B10pro cells were predominantly found within the CD24hiCD27+ B-cell subpopulation that was able to negatively regulate monocyte cytokine production through IL-10–dependent pathways during in vitro functional assays. Blood B10 cells were present in 91 patients with rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, primary Sjögren syndrome, autoimmune vesiculobullous skin disease, or multiple sclerosis, and were expanded in some cases as occurs in mice with autoimmune disease. Mean B10 + B10pro-cell frequencies were also significantly higher in patients with autoimmune disease compared with healthy controls. The characterization of human B10 cells will facilitate their identification and the study of their regulatory activities during human disease.

EAE is a mouse T cell–mediated autoimmune disease of the CNS used to model the human condition MS. The contributions of B cells to EAE initiation and progression are unclear. In this study, we have shown that EAE disease initiation and progression are differentially influenced by the depletion of B cells from mice with otherwise intact immune systems. CD20 antibody–mediated B cell depletion before EAE induction substantially exacerbated disease symptoms and increased encephalitogenic T cell influx into the CNS. Increased symptom severity resulted from the depletion of a rare IL-10–producing CD1dhiCD5+ regulatory B cell subset (B10 cells), since the adoptive transfer of splenic B10 cells before EAE induction normalized EAE in B cell–depleted mice. While transfer of regulatory B10 cells was maximally effective during early EAE initiation, they had no obvious role during disease progression. Rather, B cell depletion during EAE disease progression dramatically suppressed symptoms. Specifically, B cells were required for the generation of CD4+ T cells specific for CNS autoantigen and the entry of encephalitogenic T cells into the CNS during disease progression. These results demonstrate reciprocal regulatory roles for B cells during EAE immunopathogenesis. The therapeutic effect of B cell depletion for the treatment of autoimmunity may therefore depend on the relative contributions and the timing of these opposing B cell activities during the course of disease initiation and pathogenesis.

IL-21- and CD40-dependent cognate interactions with T cells are identified as key drivers for the generation of IL-10-producing regulatory B cells, which can protect against autoimmune disease. Subsets of regulatory B cells have been identified in both mice and humans, including the regulatory B10 cell subset that produces the inhibitory cytokine interleukin-10 (IL-10). B-cell derived IL-10 can protect against autoimmune disease in mice. Here, Thomas Tedder and colleagues identify IL-21- and CD-40-dependent cognate interactions with T cells as key drivers for the generation of IL-10-producing CD5+ regulatory B cells. Transfer of in vitro-expanded regulatory B cells is shown to suppress signs of disease in the experimental autoimmune encephalomyelitis mouse model of multiple sclerosis. This work suggests a novel strategy for the treatment of severe autoimmune diseases for which effective therapies are not available. B cells regulate immune responses by producing antigen-specific antibodies1. However, specific B-cell subsets can also negatively regulate T-cell immune responses, and have been termed regulatory B cells2,3,4. Human and mouse regulatory B cells (B10 cells) with the ability to express the inhibitory cytokine interleukin-10 (IL-10) have been identified2,3,4,5. Although rare, B10 cells are potent negative regulators of antigen-specific inflammation and T-cell-dependent autoimmune diseases in mice5,6,7. How B10-cell IL-10 production and regulation of antigen-specific immune responses are controlled in vivo without inducing systemic immunosuppression is unknown. Using a mouse model for multiple sclerosis, here we show that B10-cell maturation into functional IL-10-secreting effector cells that inhibit in vivo autoimmune disease requires IL-21 and CD40-dependent cognate interactions with T cells. Moreover, the ex vivo provision of CD40 and IL-21 receptor signals can drive B10-cell development and expansion by four-million-fold, and generate B10 effector cells producing IL-10 that markedly inhibit disease symptoms when transferred into mice with established autoimmune disease. The ex vivo expansion and reinfusion of autologous B10 cells may provide a novel and effective in vivo treatment for severe autoimmune diseases that are resistant to current therapies.

The purpose of this work was to develop an efficient method for the production of adeno-associated virus (AAV) vectors in the absence of helper virus. The adenovirus regions that mediate AAV vector replication were identified and assembled into a helper plasmid. These included the VA, E2A and E4 regions. When this helper plasmid was cotransfected into 293 cells, along with plasmids encoding the AAV vector, and rep and cap genes, AAV vector was produced as efficiently as when using adenovirus infection as a source of help. CMV-driven constructs expressing the E4orf6 and the 72-M(r), E2A proteins were able to functionally replace the E4 and E2A regions, respectively. Therefore the minimum set of genes required to produce AAV helper activity equivalent to that provided by adenovirus infection consists of, or is a subset of, the following genes: the E4orf6 gene, the 72-M(r), E2A protein gene, the VA RNA genes and the E1 region. AAV vector preparations made with adenovirus and by the helper virus-free method were essentially indistinguishable with respect to particle density, particle to infectivity ratio, capsimer ratio and efficiency of muscle transduction in vivo. Only AAV vector preparations made by the helper virus-free method were not reactive with anti-adenovirus sera.

Abstract Autoimmunity and inflammation are controlled in part by regulatory B cells, including a recently identified IL-10-competent CD1dhighCD5+ B cell subset termed B10 cells that represents 1–3% of adult mouse spleen B cells. In this study, pathways that influence B10 cell generation and IL-10 production were identified and compared with previously described regulatory B cells. IL-10-competent B cells were predominantly CD1dhighCD5+ in adult spleen and were the prevalent source of IL-10, but not other cytokines. B10 cell development and/or maturation in vivo required Ag receptor diversity and intact signaling pathways, but not T cells, gut-associated flora, or environmental pathogens. Spleen B10 cell frequencies were significantly expanded in aged mice and mice predisposed to autoimmunity, but were significantly decreased in mouse strains that are susceptible to exogenous autoantigen-induced autoimmunity. LPS, PMA, plus ionomycin stimulation in vitro for 5 h induced B10 cells to express cytoplasmic IL-10. However, prolonged LPS or CD40 stimulation (48 h) induced additional adult spleen CD1dhighCD5+ B cells to express IL-10 following PMA plus ionomycin stimulation. Prolonged LPS or CD40 stimulation of newborn spleen and adult blood or lymph node CD1dlow and/or CD5− B cells also induced cytoplasmic IL-10 competence in rare B cells, with CD40 ligation uniformly inducing CD5 expression. IL-10 secretion was induced by LPS signaling through MyD88-dependent pathways, but not following CD40 ligation. LPS stimulation also induced rapid B10 cell clonal expansion when compared with other spleen B cells. Thereby, both adaptive and innate signals regulate B10 cell development, maturation, CD5 expression, and competence for IL-10 production.

Abstract Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a T lymphocyte-mediated autoimmune disease of the CNS. Significant roles for B cells and a rare IL-10–producing CD1dhighCD5+ regulatory B cell subset (B10 cells) have been identified during the initiation and progression of EAE. Whether and how the regulatory functions of B10 cells and FoxP3+ T regulatory cells (Tregs) overlap or influence EAE immunopathogenesis independently has remained unanswered. This study demonstrates that the number of endogenous or adoptively transferred B10 cells directly influenced EAE pathogenesis through their production of IL-10. B10 cell numbers expanded quickly within the spleen, but not CNS following myelin oligodendrocyte glycoprotein35–55 immunization, which paralleled B10 cell regulation of disease initiation. The adoptive transfer of myelin oligodendrocyte glycoprotein33–35-sensitized B10 cells into wild-type mice reduced EAE initiation dramatically. However, B10 cells did not suppress ongoing EAE disease. Rather, Treg numbers expanded significantly within the CNS during disease progression, which paralleled their negative regulation of late-phase disease. Likewise, the preferential depletion of B10 cells in vivo during disease initiation enhanced EAE pathogenesis, whereas Treg depletion enhanced late-phase disease. B10 cells did not regulate T cell proliferation during in vitro assays, but significantly altered CD4+ T cell IFN-γ and TNF-α production. Furthermore, B10 cells downregulated the ability of dendritic cells to act as APCs and thereby indirectly modulated T cell proliferation. Thus, B10 cells predominantly control disease initiation, whereas Tregs reciprocally inhibit late-phase disease, with overlapping B10 cell and Treg functions shaping the normal course of EAE immunopathogenesis.

Objective To identify similarities and differences in the clinical features of adult Japanese patients with individual anti-aminoacyl-tRNA synthetase antibodies (anti-ARS Abs). Methods This was a retrospective analysis of 166 adult Japanese patients with anti-ARS Abs detected by immunoprecipitation assays. These patients had visited Kanazawa University Hospital or collaborating medical centers from 2003 to 2009. Results Anti-ARS Ab specificity included anti-Jo-1 (36%), anti-EJ (23%), anti-PL-7 (18%), anti-PL-12 (11%), anti-KS (8%), and anti-OJ (5%). These anti-ARS Abs were mutually exclusive, except for one serum Ab that had both anti-PL-7 and PL-12 reactivity. Myositis was closely associated with anti-Jo-1, anti-EJ, and anti-PL-7, while interstitial lung disease (ILD) was correlated with all 6 anti-ARS Abs. Dermatomyositis (DM)-specific skin manifestations (heliotrope rash and Gottron’s sign) were frequently observed in patients with anti-Jo-1, anti-EJ, anti-PL-7, and anti-PL-12. Therefore, most clinical diagnoses were polymyositis or DM for anti-Jo-1, anti-EJ, and anti-PL-7; clinically amyopathic DM or ILD for anti-PL-12; and ILD for anti-KS and anti-OJ. Patients with anti-Jo-1, anti-EJ, and anti-PL-7 developed myositis later if they had ILD alone at the time of disease onset, and most patients with anti-ARS Abs eventually developed ILD if they did not have ILD at disease onset. Conclusion Patients with anti-ARS Abs are relatively homogeneous. However, the distribution and timing of myositis, ILD, and rashes differ among patients with individual anti-ARS Abs. Thus, identification of individual anti-ARS Abs is beneficial to define this rather homogeneous subset and to predict clinical outcomes within the “anti-synthetase syndrome.”

Objective

 To clarify the association of clinical and prognostic features with dermatomyositis (DM)-specific autoantibodies (Abs) in adult Japanese patients with DM. 

Design

 Retrospective study. 

Setting

 Kanazawa University Graduate School of Medical Science Department of Dermatology and collaborating medical centers. 

Patients

 A total of 376 consecutive adult Japanese patients with DM who visited our hospital or collaborating medical centers between 2003 and 2008. 

Main Outcome Measures

 Clinical and laboratory characteristics of adult Japanese patients with DM and DM-specific Abs that include Abs against Mi-2, 155/140, and CADM-140. 

Results

 In patients with DM, anti–Mi-2, anti–155/140, and anti–CADM-140 were detected in 9 (2%), 25 (7%), and 43 (11%), respectively. These DM-specific Abs were mutually exclusive and were detected in none of 34 patients with polymyositis, 326 with systemic sclerosis, and 97 with systemic lupus erythematosus. Anti–Mi-2 was associated with classical DM without interstitial lung disease or malignancy, whereas anti–155/140 was associated with malignancy. Patients with anti–CADM-140 frequently had clinically amyopathic DM and rapidly progressive interstitial lung disease. Cumulative survival rates were more favorable in patients with anti–Mi-2 compared with those with anti–155/140 or anti–CADM-140 (P < .01 for both comparisons). Nearly all deaths occurred within 1 year after diagnosis in patients with anti–CADM-140. 

Conclusion

 Dermatomyositis-specific Abs define clinically distinct subsets and are useful for predicting clinical outcomes in patients with DM.

Abstract Objective To identify the 140‐kd autoantigen recognized by anti‐155/140 autoantibodies that are associated with adult cancer‐associated dermatomyositis (DM) and juvenile DM and to determine the clinical relevance of anti‐155/140 antibodies in a large cohort. Methods Sera from 456 DM patients were assessed for the presence of anti‐155/140 antibodies by immunoprecipitation using K562 cell extracts as substrate. Using immunoprecipitation and Western blotting, we then examined whether anti‐155/140–positive sera recognized transcription intermediary factor 1α (TIF‐1α), TIF‐1β, and TIF‐1γ. The clinical associations of antigen reactivity were also evaluated. Results Anti‐155/140–positive sera reacted with 140‐kd TIF‐1α in addition to 155‐kd TIF‐1γ. Among sera from 456 DM patients, 52 were reactive with both TIF‐1α and TIF‐1γ, while another 25 were reactive with TIF‐1γ alone. Additionally, 7 were reactive with TIF‐1β. Malignancy was more frequently found in adult patients with both anti–TIF‐1α and anti–TIF‐1γ antibodies than in those with anti–TIF‐1γ antibodies alone (73% versus 50%; P < 0.05). In addition to juvenile DM patients and middle‐aged and older DM patients with high percentages of malignancy, 8 “young adult” DM patients without malignancy had these autoantibodies. Conclusion Anti‐155/140 antibodies target TIF‐1 family proteins, TIF‐1α and TIF‐1β, in addition to TIF‐1γ. Since TIF‐1 proteins have significant roles in oncogenesis, these antibodies may be produced during misdirected antitumor immunity.

Objectives Myositis-specific autoantibodies (MSAs) are useful tools for identifying clinically homogeneous subsets and predicting prognosis of patients with idiopathic inflammatory myopathies (IIM) including polymyositis (PM) and dermatomyositis (DM). Recent studies have shown that anti-NXP2 antibody (Ab) is a major MSA in juvenile dermatomyositis (JDM). In this study the frequencies and clinical associations of anti-NXP2 Ab were evaluated in adult patients with IIM. Methods Clinical data and serum samples were collected from 507 adult Japanese patients with IIM (445 with DM and 62 with PM). Eleven patients with JDM, 108 with systemic lupus erythematosus, 433 with systemic sclerosis and 124 with idiopathic pulmonary fibrosis were assessed as disease controls. Serum was examined for anti-NXP2 Ab by immunoprecipitation and western blotting using polyclonal anti-NXP2 Ab. Results Seven patients (1.6%) with adult DM and one (1.6%) with adult PM were positive for anti-NXP2 Ab. Except for two patients with JDM, none of the disease controls were positive for this autoantibody. Among eight adult patients with IIM, three had internal malignancies within 3 years of diagnosis of IIM. Another patient with DM also had a metastatic cancer at the diagnosis. All of the carcinomas were at an advanced stage (stage IIIb–IV). Conclusions While less common than in juvenile IIM, anti-NXP2 Ab was found in adult IIM. Anti-NXP2 Ab may be associated with adult IIM with malignancy.