Cytotoxic T lymphocytes (CTL) rapidly destroy their targets. Here we show that although target cell death occurs within 5 min of CTL-target cell contact, an immunological synapse similar to that seen in CD4 cells rapidly forms in CTL, with a ring of adhesion proteins surrounding an inner signaling molecule domain. Lytic granule secretion occurs in a separate domain within the adhesion ring, maintaining signaling protein organization during exocytosis. Live and fixed cell studies show target cell plasma membrane markers are transferred to the CTL as the cells separate. Electron microscopy reveals continuities forming membrane bridges between the CTL and target cell membranes, suggesting a possible mechanism for this transfer.

Rab27a activity is affected in several mouse models of human disease including Griscelli (ashen mice) and Hermansky-Pudlak (gunmetal mice) syndromes. A loss of function mutation occurs in the Rab27a gene in ashen (ash), whereas in gunmetal (gm) Rab27a dysfunction is secondary to a mutation in the α subunit of Rab geranylgeranyl transferase, an enzyme required for prenylation and activation of Rabs. We show here that Rab27a is normally expressed in cytotoxic T lymphocytes (CTLs), but absent in ashen homozygotes (ash/ash). Cytotoxicity and secretion assays show that ash/ash CTLs are unable to kill target cells or to secrete granzyme A and hexosaminidase. By immunofluorescence and electron microscopy, we show polarization but no membrane docking of ash/ash lytic granules at the immunological synapse. In gunmetal CTLs, we show underprenylation and redistribution of Rab27a to the cytosol, implying reduced activity. Gunmetal CTLs show a reduced ability to kill target cells but retain the ability to secrete hexosaminidase and granzyme A. However, only some of the granules polarize to the immunological synapse, and many remain dispersed around the periphery of the CTLs. These results demonstrate that Rab27a is required in a final secretory step and that other Rab proteins also affected in gunmetal are likely to be involved in polarization of the granules to the immunological synapse.

The immune microenvironment influences tumour evolution and can be both prognostic and predict response to immunotherapy1,2. However, measurements of tumour infiltrating lymphocytes (TILs) are limited by a shortage of appropriate data. Whole-exome sequencing (WES) of DNA is frequently performed to calculate tumour mutational burden and identify actionable mutations. Here we develop T cell exome TREC tool (T cell ExTRECT), a method for estimation of T cell fraction from WES samples using a signal from T cell receptor excision circle (TREC) loss during V(D)J recombination of the T cell receptor-α gene (TCRA (also known as TRA)). TCRA T cell fraction correlates with orthogonal TIL estimates and is agnostic to sample type. Blood TCRA T cell fraction is higher in females than in males and correlates with both tumour immune infiltrate and presence of bacterial sequencing reads. Tumour TCRA T cell fraction is prognostic in lung adenocarcinoma. Using a meta-analysis of tumours treated with immunotherapy, we show that tumour TCRA T cell fraction predicts immunotherapy response, providing value beyond measuring tumour mutational burden. Applying T cell ExTRECT to a multi-sample pan-cancer cohort reveals a high diversity of the degree of immune infiltration within tumours. Subclonal loss of 12q24.31–32, encompassing SPPL3, is associated with reduced TCRA T cell fraction. T cell ExTRECT provides a cost-effective technique to characterize immune infiltrate alongside somatic changes. A robust, cost-effective technique based on whole-exome sequencing data can be used to characterize immune infiltrates, relate the extent of these infiltrates to somatic changes in tumours, and enables prediction of tumour responses to immune checkpoint inhibition therapy.

Abstract The phenomenon of mixed/heterogenous treatment responses to cancer therapies within an individual patient presents a challenging clinical scenario. Furthermore, the molecular basis of mixed intra-patient tumor responses remains unclear. Here, we show that patients with metastatic lung adenocarcinoma harbouring co-mutations of EGFR and TP53 , are more likely to have mixed intra-patient tumor responses to EGFR tyrosine kinase inhibition (TKI), compared to those with an EGFR mutation alone. The combined presence of whole genome doubling (WGD) and TP53 co-mutations leads to increased genome instability and genomic copy number aberrations in genes implicated in EGFR TKI resistance. Using mouse models and an in vitro isogenic p53 -mutant model system, we provide evidence that WGD provides diverse routes to drug resistance by increasing the probability of acquiring copy-number gains or losses relative to non-WGD cells. These data provide a molecular basis for mixed tumor responses to targeted therapy, within an individual patient, with implications for therapeutic strategies.

Patient-derived xenograft (PDX) models are widely used in cancer research. To investigate the genomic fidelity of non-small cell lung cancer PDX models, we established 48 PDX models from 22 patients enrolled in the TRACERx study. Multi-region tumor sampling increased successful PDX engraftment and most models were histologically similar to their parent tumor. Whole-exome sequencing enabled comparison of tumors and PDX models and we provide an adapted mouse reference genome for improved removal of NOD scid gamma (NSG) mouse-derived reads from sequencing data. PDX model establishment caused a genomic bottleneck, with models often representing a single tumor subclone. While distinct tumor subclones were represented in independent models from the same tumor, individual PDX models did not fully recapitulate intratumor heterogeneity. On-going genomic evolution in mice contributed modestly to the genomic distance between tumors and PDX models. Our study highlights the importance of considering primary tumor heterogeneity when using PDX models and emphasizes the benefit of comprehensive tumor sampling.