A combination of a sensitive blue light–gated channelrhodopsin actuator and red-shifted Arch-based voltage sensors allows all-optical electrophysiology without cross-talk in cultured neurons or brain slices. All-optical electrophysiology—spatially resolved simultaneous optical perturbation and measurement of membrane voltage—would open new vistas in neuroscience research. We evolved two archaerhodopsin-based voltage indicators, QuasAr1 and QuasAr2, which show improved brightness and voltage sensitivity, have microsecond response times and produce no photocurrent. We engineered a channelrhodopsin actuator, CheRiff, which shows high light sensitivity and rapid kinetics and is spectrally orthogonal to the QuasArs. A coexpression vector, Optopatch, enabled cross-talk–free genetically targeted all-optical electrophysiology. In cultured rat neurons, we combined Optopatch with patterned optical excitation to probe back-propagating action potentials (APs) in dendritic spines, synaptic transmission, subcellular microsecond-timescale details of AP propagation, and simultaneous firing of many neurons in a network. Optopatch measurements revealed homeostatic tuning of intrinsic excitability in human stem cell–derived neurons. In rat brain slices, Optopatch induced and reported APs and subthreshold events with high signal-to-noise ratios. The Optopatch platform enables high-throughput, spatially resolved electrophysiology without the use of conventional electrodes.

The microbial rhodopsin protein, Archaerhodopsin 3, can function as a rapid and highly sensitive genetically encoded voltage indicator in mammalian cells that is capable of detecting single action potentials with a signal-to-noise ratio greater than 10. A mutant lacking proton pumping displays greater sensitivity but a slowed response. Reliable optical detection of single action potentials in mammalian neurons has been one of the longest-standing challenges in neuroscience. Here we achieved this goal by using the endogenous fluorescence of a microbial rhodopsin protein, Archaerhodopsin 3 (Arch) from Halorubrum sodomense, expressed in cultured rat hippocampal neurons. This genetically encoded voltage indicator exhibited an approximately tenfold improvement in sensitivity and speed over existing protein-based voltage indicators, with a roughly linear twofold increase in brightness between −150 mV and +150 mV and a sub-millisecond response time. Arch detected single electrically triggered action potentials with an optical signal-to-noise ratio >10. Arch(D95N) lacked endogenous proton pumping and had 50% greater sensitivity than wild type but had a slower response (41 ms). Nonetheless, Arch(D95N) also resolved individual action potentials. Microbial rhodopsin–based voltage indicators promise to enable optical interrogation of complex neural circuits and electrophysiology in systems for which electrode-based techniques are challenging.