Nitrotyrosine is widely used as a marker of post-translational modification by the nitric oxide (⋅NO, nitrogen monoxide)-derived oxidant peroxynitrite (ONOO−). However, since the discovery that myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO) can generate nitrotyrosine via oxidation of nitrite (NO 2−), several questions have arisen. First, the relative contribution of peroxidases to nitrotyrosine formation in vivo is unknown. Further, although evidence suggests that the one-electron oxidation product, nitrogen dioxide (⋅NO2), is the primary species formed, neither a direct demonstration that peroxidases form this gas nor studies designed to test for the possible concomitant formation of the two-electron oxidation product, ONOO−, have been reported. Using multiple distinct models of acute inflammation with EPO- and MPO-knockout mice, we now demonstrate that leukocyte peroxidases participate in nitrotyrosine formation in vivo. In some models, MPO and EPO played a dominant role, accounting for the majority of nitrotyrosine formed. However, in other leukocyte-rich acute inflammatory models, no contribution for either MPO or EPO to nitrotyrosine formation could be demonstrated. Head-space gas analysis of helium-swept reaction mixtures provides direct evidence that leukocyte peroxidases catalytically generate ⋅NO2formation using H2O2 and NO 2− as substrates. However, formation of an additional oxidant was suggested since both enzymes promote NO 2−-dependent hydroxylation of targets under acidic conditions, a chemical reactivity shared with ONOO− but not ⋅NO2. Collectively, our results demonstrate that: 1) MPO and EPO contribute to tyrosine nitration in vivo; 2) the major reactive nitrogen species formed by leukocyte peroxidase-catalyzed oxidation of NO 2− is the one-electron oxidation product, ⋅NO2; 3) as a minor reaction, peroxidases may also catalyze the two-electron oxidation of NO 2−, producing a ONOO−-like product. We speculate that the latter reaction generates a labile Fe-ONOO complex, which may be released following protonation under acidic conditions such as might exist at sites of inflammation. Nitrotyrosine is widely used as a marker of post-translational modification by the nitric oxide (⋅NO, nitrogen monoxide)-derived oxidant peroxynitrite (ONOO−). However, since the discovery that myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO) can generate nitrotyrosine via oxidation of nitrite (NO 2−), several questions have arisen. First, the relative contribution of peroxidases to nitrotyrosine formation in vivo is unknown. Further, although evidence suggests that the one-electron oxidation product, nitrogen dioxide (⋅NO2), is the primary species formed, neither a direct demonstration that peroxidases form this gas nor studies designed to test for the possible concomitant formation of the two-electron oxidation product, ONOO−, have been reported. Using multiple distinct models of acute inflammation with EPO- and MPO-knockout mice, we now demonstrate that leukocyte peroxidases participate in nitrotyrosine formation in vivo. In some models, MPO and EPO played a dominant role, accounting for the majority of nitrotyrosine formed. However, in other leukocyte-rich acute inflammatory models, no contribution for either MPO or EPO to nitrotyrosine formation could be demonstrated. Head-space gas analysis of helium-swept reaction mixtures provides direct evidence that leukocyte peroxidases catalytically generate ⋅NO2formation using H2O2 and NO 2− as substrates. However, formation of an additional oxidant was suggested since both enzymes promote NO 2−-dependent hydroxylation of targets under acidic conditions, a chemical reactivity shared with ONOO− but not ⋅NO2. Collectively, our results demonstrate that: 1) MPO and EPO contribute to tyrosine nitration in vivo; 2) the major reactive nitrogen species formed by leukocyte peroxidase-catalyzed oxidation of NO 2− is the one-electron oxidation product, ⋅NO2; 3) as a minor reaction, peroxidases may also catalyze the two-electron oxidation of NO 2−, producing a ONOO−-like product. We speculate that the latter reaction generates a labile Fe-ONOO complex, which may be released following protonation under acidic conditions such as might exist at sites of inflammation. Nitric oxide (⋅NO, nitrogen monoxide)-derived oxidants are believed to participate in antimicrobicidal activities as part of normal host defenses, cell signaling reactions, and a variety of homeostatic mechanisms. However, excess or inappropriate formation of NO-derived oxidants has also been linked to oxidative tissue injury and protein modification through nitration of tyrosine residues in inflammatory disorders (1Beckman J.S. Koppenol W.H. Am. J. Physiol. 1996; 271: C1424-C1452Crossref PubMed Google Scholar, 2Halliwell B. Zhao K. Whiteman M. Free Radic. Res. 1999; 31: 651-669Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar, 3Patel R.P. McAndrew J. Sellak H. White C.R., Jo, H. Freeman B.S. Darley-Usmar V.M. Biochem. Biophys. Acta. 1999; 1411: 385-400Crossref PubMed Scopus (417) Google Scholar, 4van der Vliet A. Eiserich J.P. Shigenaga M.K. Cross C.E. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999; 160: 1-9Crossref PubMed Scopus (283) Google Scholar). Evidence of a role for NO-derived oxidants in oxidative damage is primarily based upon immunohistological and mass spectrometric detection of nitrotyrosine (NO2-Tyr) (5Beckman J.S. Ye Y.Z. Anderson P. Chen J. Accaretti M.A. Tarpey M.M. White C.R. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1994; 375: 81-88Crossref PubMed Scopus (1091) Google Scholar, 6Leeuwenburgh C. Hardy M.M. Hazen S.L. Wagner P. Oh-ishi S. Steinbrecher U.P. Heinecke J.W. J. Biol. Chem. 1997; 272: 1433-1436Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (433) Google Scholar, 7Hazen S.L. Hsu F.F. Gaut J.P. Crowley J.R. Heinecke J.W. Methods Enzymol. 1999; 300: 88-105Crossref PubMed Scopus (77) Google Scholar). Although originally thought to serve as a specific marker for protein oxidation by peroxynitrite (ONOO−), it is now clear that a variety of reactive species may promote nitration of protein tyrosine (Tyr) residues in vitro. However, neither the identity nor the relative contribution of distinct intermediates in nitration reactions in vivo is known. By far the most widely studied nitrating intermediate is ONOO−, the reactive species formed during near diffusion-limited interaction of superoxide (O 2•−) and ⋅NO (1Beckman J.S. Koppenol W.H. Am. J. Physiol. 1996; 271: C1424-C1452Crossref PubMed Google Scholar). ONOO− promotes both nitration and hydroxylation reactions of targets and may be described as possessing chemical reactivity akin to a pair of caged radicals: hydroxyl radical (⋅OH) and nitrogen dioxide (⋅NO2) (1Beckman J.S. Koppenol W.H. Am. J. Physiol. 1996; 271: C1424-C1452Crossref PubMed Google Scholar). Recent studies demonstrate that at physiological levels of carbon dioxide/bicarbonate (CO2/HCO 3−), ONOO− predominantly exists as the more potent nitrating species, nitrosoperoxocarbonate (ONOOCO2 −) (8Gow A. Duran D. Thom S.R. Ischiropoulos H. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 333: 42-48Crossref PubMed Scopus (279) Google Scholar, 9Lymar S.V. Jiang Q. Hurst J.K. Biochemistry. 1996; 35: 7855-7861Crossref PubMed Scopus (316) Google Scholar, 10Radi R. Denicola A. Freeman B.A. Methods Enzymol. 1999; 301: 353-367Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar). Production of ⋅NO and O 2•− is a characteristic feature at sites of inflammation. Consequently, both potential adverse effects of excess ⋅NO production and the detection of nitrotyrosine have been predominantly attributed to formation of ONOO− and ONOOCO2 −(1Beckman J.S. Koppenol W.H. Am. J. Physiol. 1996; 271: C1424-C1452Crossref PubMed Google Scholar, 2Halliwell B. Zhao K. Whiteman M. Free Radic. Res. 1999; 31: 651-669Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar, 3Patel R.P. McAndrew J. Sellak H. White C.R., Jo, H. Freeman B.S. Darley-Usmar V.M. Biochem. Biophys. Acta. 1999; 1411: 385-400Crossref PubMed Scopus (417) Google Scholar, 4van der Vliet A. Eiserich J.P. Shigenaga M.K. Cross C.E. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999; 160: 1-9Crossref PubMed Scopus (283) Google Scholar, 8Gow A. Duran D. Thom S.R. Ischiropoulos H. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 333: 42-48Crossref PubMed Scopus (279) Google Scholar, 9Lymar S.V. Jiang Q. Hurst J.K. Biochemistry. 1996; 35: 7855-7861Crossref PubMed Scopus (316) Google Scholar, 10Radi R. Denicola A. Freeman B.A. Methods Enzymol. 1999; 301: 353-367Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar). Over the past several years, substantial evidence has accrued suggesting that leukocyte peroxidases may also serve as enzymatic participants in generation of reactive nitrogen species (11van der Vliet A. Eiserich J.P. Halliwell B. Cross C.E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7617-7625Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (728) Google Scholar, 12Eiserich J.P. Hristova M. Cross C.E. Jones A.D. Freeman B.A. Halliwell B. van der Vliet A. Nature. 1998; 391: 393-397Crossref PubMed Scopus (1379) Google Scholar, 13Wu W. Chen Y. Hazen S.L. J. Biol. Chem. 1999; 274: 25933-25944Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (254) Google Scholar, 14Hazen S.L. Zhang R. Shen Z., Wu, W. Podrez E.A. MacPherson J.C. Schmitt D. Mitra S.N. Mukhopadhyay C. Chen Y. Cohen P.A. Hoff H.F. Abu-Soud H.M. Circ. Res. 1999; 85: 950-958Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar, 15Baldus S. Eiserich J.P. Mani A. Castro L Figueroa M. Chumley P., Ma, W. Tousson A. White C.R. Bullard D.C. Brennan M.L. Lusis A.J. Moore K.P. Freeman B.A. J. Clin. Invest. 2001; 108: 1759-1770Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar). Neutrophils, monocytes, and eosinophils are the terminal effector cells of the innate immune system and are abundant cellular constituents at sites of inflammation. The leukocyte peroxidases myeloperoxidase (MPO) 1The abbreviations used are: MPOmyeloperoxidaseBHTbutylated hydroxytolueneDHBdihydroxybenzoic acidDOPA3,4-dihydroxyphenylalanineDTPAdiethylenetriaminepentaacetic acidEPOeosinophil peroxidaseESIelectrospray ionizationGCgas chromatographyHPA3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acidHPLChigh performance liquid chromatographyKOknock-outLCliquid chromatographyMSmass spectrometrym/zmass-to-charge-ratioPBSphosphate buffered salineSAsalicylateWTwild-type and eosinophil peroxidase (EPO) are some of the most abundant proteins in these cells (16Shultz J. Kaminker K. Arch. Biochem. Biophys. 1962; 96: 465-467Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar, 17Bos A. Wever R. Dirk R. Biochim. Biophys. Acta. 1978; 525: 37-44Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 18Carlson M.G. Peterson C.G. Venge P. J. Immunol. 1985; 134: 1875-1879PubMed Google Scholar). They utilize hydrogen peroxide (H2O2) and a variety of organic and inorganic low molecular weight substrates to generate an array of reactive oxidants and diffusible radical species, including nitrating intermediates (19Dunford H.B. Adv. Inorg. Biochem. 1982; 4: 41-48Google Scholar, 20Hampton M.B. Kettle A.J. Winterbourn C.C. Blood. 1998; 92: 3007-3017Crossref PubMed Google Scholar, 21Podrez E.A. Abu-Soud H. Hazen S.L. Free Radic. Biol. Med. 2000; 28: 1717-1725Crossref PubMed Scopus (546) Google Scholar, 22Mitra S.N. Slungaard A. Hazen S.L. Redox Rep. 2000; 5: 215-224Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar). MPO and EPO are unique in their ability to use halides and pseudohalides as co-substrates to generate hypohalous acids. At plasma levels of halides (Cl−, 100 mm; Br−, 100 μm), MPO uses Cl− as co-substrate to form hypochlorous acid (HOCl) (23Harrison J.E. Schultz J. J. Biol. Chem. 1976; 251: 1371-1374Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Foote C.S. Goyne T.E. Lehrer R.I. Nature. 1981; 301: 715-716Crossref Scopus (233) Google Scholar) and molecular chlorine (Cl2) (25Hazen S.L. Hsu F.F. Mueller D.M. Crowley J.R. Heinecke J.W. J. Clin. Invest. 1996; 98: 1283-1289Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar) as chlorinating oxidants. In contrast, EPO selectively utilizes plasma levels of Br− over Cl− to generate hypobromous acid (26Weiss S.J. Test S.T. Eckmann C.M. Roos D. Regiania S. Science. 1986; 234: 200-202Crossref PubMed Scopus (216) Google Scholar). We have shown that chlorotyrosine (Cl-Tyr) and bromotyrosine (Br-Tyr) serve as specific markers of protein oxidation by MPO- and EPO-generated chlorinating and brominating oxidants, respectively, in vitro (27Hazen S.L. Heinecke J.W. J. Clin. Invest. 1997; 99: 1-7Crossref PubMed Scopus (755) Google Scholar, 28Podrez E.A. Schmitt D. Hoff H.F. Hazen S.L. J. Clin. Invest. 1999; 103: 1547-1560Crossref PubMed Scopus (427) Google Scholar, 29Wu W. Chen Y. d'Avignon A. Hazen S.L. Biochemistry. 1999; 38: 3538-3548Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar) and in vivo (30Wu W. Samoszuk M.K. Comhair S.A.A. Thomassen M.J. Farver C.F. Dweik R.A. Kavuru M.S. Erzurum S.C. Hazen S.L. J. Clin. Invest. 2000; 105: 1455-1463Crossref PubMed Scopus (270) Google Scholar, 31Brennan M.L. Anderson M.M. Shih D.M. Qu X.D. Wang X.P. Mehta A.C. Lim L.L. Shi W. Hazen S.L. Jacob J.S. Crowley J.R. Heinecke J.W. Lusis A.J. J. Clin. Invest. 2001; 107: 419-430Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar, 32Denzler K.L. Borchers M.T. Crosby J.R. Cieslewicz G. Hines E.M. Justice J.P. Cormier S.A. Lindernberger K.A. Song W., Wu, W. Hazen S.L. Gleich G.J. Lee J.J. Lee N.A. J. Immunol. 2001; 167: 1672-1682Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar, 33MacPherson, J. C., Comhair, S. A. A., Erzurum, S. C., Klein, D. F., Lipscomb, M. F., Kavuru, M. S., Samoszuk, M. K., and Hazen, S. L. (2001) J. Immunol. 5763–5772Google Scholar). myeloperoxidase butylated hydroxytoluene dihydroxybenzoic acid 3,4-dihydroxyphenylalanine diethylenetriaminepentaacetic acid eosinophil peroxidase electrospray ionization gas chromatography 3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid high performance liquid chromatography knock-out liquid chromatography mass spectrometry mass-to-charge-ratio phosphate buffered saline salicylate wild-type Because of the high levels of halides in biological matrices, halogenating oxidants were thought to account for the major reactive species formed by MPO and EPO. However, recent in vitro studies with purified enzymes and isolated leukocytes have shown that MPO (11van der Vliet A. Eiserich J.P. Halliwell B. Cross C.E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7617-7625Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (728) Google Scholar, 12Eiserich J.P. Hristova M. Cross C.E. Jones A.D. Freeman B.A. Halliwell B. van der Vliet A. Nature. 1998; 391: 393-397Crossref PubMed Scopus (1379) Google Scholar, 14Hazen S.L. Zhang R. Shen Z., Wu, W. Podrez E.A. MacPherson J.C. Schmitt D. Mitra S.N. Mukhopadhyay C. Chen Y. Cohen P.A. Hoff H.F. Abu-Soud H.M. Circ. Res. 1999; 85: 950-958Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar, 28Podrez E.A. Schmitt D. Hoff H.F. Hazen S.L. J. Clin. Invest. 1999; 103: 1547-1560Crossref PubMed Scopus (427) Google Scholar) and EPO (13Wu W. Chen Y. Hazen S.L. J. Biol. Chem. 1999; 274: 25933-25944Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (254) Google Scholar, 33MacPherson, J. C., Comhair, S. A. A., Erzurum, S. C., Klein, D. F., Lipscomb, M. F., Kavuru, M. S., Samoszuk, M. K., and Hazen, S. L. (2001) J. Immunol. 5763–5772Google Scholar) are capable of promoting aromatic nitration reactions through the use of nitrite (NO 2−) as substrate, even in the presence of plasma levels of halides (28Podrez E.A. Schmitt D. Hoff H.F. Hazen S.L. J. Clin. Invest. 1999; 103: 1547-1560Crossref PubMed Scopus (427) Google Scholar, 33MacPherson, J. C., Comhair, S. A. A., Erzurum, S. C., Klein, D. F., Lipscomb, M. F., Kavuru, M. S., Samoszuk, M. K., and Hazen, S. L. (2001) J. Immunol. 5763–5772Google Scholar). Peroxidases are capable of catalyzing both one- and two-electron oxidation reactions of substrates (19Dunford H.B. Adv. Inorg. Biochem. 1982; 4: 41-48Google Scholar, 20Hampton M.B. Kettle A.J. Winterbourn C.C. Blood. 1998; 92: 3007-3017Crossref PubMed Google Scholar, 21Podrez E.A. Abu-Soud H. Hazen S.L. Free Radic. Biol. Med. 2000; 28: 1717-1725Crossref PubMed Scopus (546) Google Scholar, 22Mitra S.N. Slungaard A. Hazen S.L. Redox Rep. 2000; 5: 215-224Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar,34Abu-Soud H.M. Khassawneh M.Y. Sohn J.T. Murray P. Haxhiu M.A. Hazen S.L. Biochemistry. 2001; 39: 11866-11875Crossref Scopus (73) Google Scholar). Consequently, both one- and two-electron oxidation products of NO 2− have been suggested to serve as potential diffusible oxidants formed by MPO and EPO (11van der Vliet A. Eiserich J.P. Halliwell B. Cross C.E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7617-7625Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (728) Google Scholar, 35Sampson J.B., Ye, Y. Rosen H. Beckman J.S. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 2: 207-213Crossref Scopus (301) Google Scholar). The formal oxidation states of nitrogen in NO 2− and its potential one- and two-electron oxidation products include: nitrite (NO 2−; +3), nitrogen dioxide (⋅NO2; +4), nitronium cation (NO2 +; +5), and peroxynitrite (ONOO−; +5). Although the reactive nitrogen species formed following peroxidase-catalyzed oxidation of NO 2− have not been directly established, rapid kinetics studies support formation of the one-electron oxidation product, ⋅NO2 (36Burner U. Furtmuller P.G. Kettle A.J. Koppenol W.H. Obinger C. J. Biol. Chem. 2000; 275: 20597-20601Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (212) Google Scholar). It has been proposed that peroxidases might also generate the two-electron oxidation product of NO 2−, ONOO−, in reactions analogous to the addition of OH to halides forming hypohalous acids (35Sampson J.B., Ye, Y. Rosen H. Beckman J.S. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 2: 207-213Crossref Scopus (301) Google Scholar). However, direct evidence to support formation of ONOO− by peroxidases has not yet been reported. The relative contributions of peroxidases to formation of⋅NO-derived oxidants in vivo are unknown. Similarly, few studies have characterized the nature of the nitrating intermediate(s) formed following peroxidase-catalyzed oxidation of NO 2−. Herein we have utilized recently developed MPO knockout (KO) (31Brennan M.L. Anderson M.M. Shih D.M. Qu X.D. Wang X.P. Mehta A.C. Lim L.L. Shi W. Hazen S.L. Jacob J.S. Crowley J.R. Heinecke J.W. Lusis A.J. J. Clin. Invest. 2001; 107: 419-430Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar) and EPO-KO (32Denzler K.L. Borchers M.T. Crosby J.R. Cieslewicz G. Hines E.M. Justice J.P. Cormier S.A. Lindernberger K.A. Song W., Wu, W. Hazen S.L. Gleich G.J. Lee J.J. Lee N.A. J. Immunol. 2001; 167: 1672-1682Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar) mice to provide evidence for the contributions of leukocyte peroxidases to protein NO2-Tyr formation in vivo using multiple distinct models of inflammation. We also provide direct evidence that⋅NO2 gas is a physiological oxidant formed as a preferred product during MPO- and EPO-catalyzed oxidation of NO 2−. Finally, we provide several lines of evidence suggesting that MPO and EPO can also utilize NO 2− as substrate to form a ONOO−-like oxidant, which may be liberated from a labile Fe-ONOO complex at acid pH. Solvents H3PO4, NaH2PO4, and Na2HPO4were purchased from Fisher Chemical Co. Chelex 100 resin (200–400 mesh, sodium form) was purchased from BioRad. Methane sulfonic acid and bromide were from Fluka Chemical Co. (Ronkonkoma, NY). l-[13C6]tyrosine, [13C9 15N1]tyrosine, and l-[2H4]tyrosine were purchased from Cambridge Isotopes, Inc. (Andover, MA). Deoxy[1′,2′-3H]guanosine, 5′-triphosphate was obtained from Amersham Biosciences, Inc. All other reagents were purchased from Sigma unless otherwise indicated. All gasses were of the highest quality available (Praxair, Cleveland, OH). The animal studies described were all performed using approved protocols from the Animal Research Committees of the Cleveland Clinic Foundation and Mayo Clinic Foundation. 129/SvJ age- and sex-matched EPO-KO and wild-type (WT) mice were used for the allergen lung challenge and helminth antigen-induced peritonitis studies. Age- and sex-matched C57BL/6J MPO-KO and WT mice (>96% genetic homogeneity) were used for candidiasis and thioglycollate/zymosan-induced peritonitis studies. EPO-KO and WT mice were sensitized or sham treated by intraperitoneal injection with either normal saline as control or 20 μg of ovalbumin (grade IV, Sigma) and 2.25 mg of Imject® Alum (Pierce) on days 0 and 14. On days 24, 25, and 26, animals were challenged with 20-min inhalations of a 1% ovalbumin or normal saline aerosol. On day 28, bronchoalveolar lavage fluid was obtained by normal saline lavage, and differentials were performed on cytospin preparations of isolated cells. Lung tissue was harvested and immediately placed in antioxidant buffer consisting of phosphate-buffered saline (PBS) supplemented with 100 μmbutylated hydroxytoluene (BHT) and 100 μM diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) overlaid with argon and stored at –80 °C until analysis. EPO-KO and WT mice were sensitized by subcutaneous injection with 250 μg of whole protein extract from the helminth Mesocestoides corti and 8 × 109 heat-killed pertussis organisms (Michigan Department of Public Health, Lansing, MI). Animals were challenged on day 21 by intraperitoneal injection with 200 μg of M. corti. At 72 h, elicited peritoneal leukocytes (typically >2 × 106 cells, ≫25% eosinophils) were activated by intraperitoneal injection with zymosan (250 mg/kg of body weight). Peritoneal lavage was performed 4 h later with PBS containing 100 μm BHT and 100 μm DTPA, and centrifugation at 1000 rpm for 10 min at 4 °C was used to separate recovered peritoneal cells and lavage fluid. Cell pellets were resuspended in PBS containing 100 μm BHT and 100 μm DTPA, and differentials were performed on cytospin preparations of isolated cells. Both cells and cell-free lavage fluid were overlaid with argon, immediately frozen, and stored at −80 °C until analysis. Superoxide production was measured as the superoxide dismutase-inhibitable reduction of cytochrome c (37Fridovich I. Greenwald R.A. CRC Handbook of Methods: Oxygen Radical Research. CRC Press, Boca Raton, FL1985: 213-215Google Scholar, 38Mayo L.A. Curnutte J.T. Methods Enzymol. 1990; 186: 567-575Crossref PubMed Scopus (143) Google Scholar) using eosinophils isolated from EPO-KO and WT mice on an interleukin-5 transgenic background (to induce eosinophilia) as described (32Denzler K.L. Borchers M.T. Crosby J.R. Cieslewicz G. Hines E.M. Justice J.P. Cormier S.A. Lindernberger K.A. Song W., Wu, W. Hazen S.L. Gleich G.J. Lee J.J. Lee N.A. J. Immunol. 2001; 167: 1672-1682Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar), and neutrophils were isolated from MPO-KO and WT mice as described (31Brennan M.L. Anderson M.M. Shih D.M. Qu X.D. Wang X.P. Mehta A.C. Lim L.L. Shi W. Hazen S.L. Jacob J.S. Crowley J.R. Heinecke J.W. Lusis A.J. J. Clin. Invest. 2001; 107: 419-430Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar). Candida albicans was cultured in Sabouraud dextrose broth, collected by centrifugation, washed in ice-cold water, and resuspended in sterile normal saline. Inocula were prepared and injected intraperitoneally into MPO-KO and WT mice. Peritoneal lavage was performed 24 h later with PBS containing 100 μm BHT and 100 μm DTPA, and centrifugation at 1000 rpm for 10 min at 4 °C was used to separate recovered peritoneal cells and lavage fluid. Cell pellets were resuspended in PBS containing 100 μm BHT and 100 μm DTPA, and differentials were performed on cytospin preparations of isolated cells. Both cells and cell-free lavage fluid were overlaid with argon, immediately frozen, and stored at −80 °C until analysis. MPO-KO and WT animals were injected intraperitoneally with 1 ml of 4% thioglycollate broth. Twenty hours after recruitment, mice were injected with zymosan (250 mg/kg). Peritoneal lavage was performed 4 h later with PBS containing 100 μm BHT and 100 μm DTPA, and centrifugation at 1000 rpm for 10 min at 4 °C was used to separate recovered peritoneal cells and lavage fluid. Cell pellets were resuspended in PBS containing 100 μm BHT and 100 μm DTPA, and differentials were performed on cytospin preparations of isolated cells. Both cells and cell-free lavage fluid were overlaid with argon, immediately frozen, and stored at −80 °C until analysis. Cells were visually counted using a hemacytometer. Wright's Giemsa stain was used to stain samples, and the cell type was distinguished microscopically based on staining morphology. Lung tissue and cell pellets were thawed and immediately homogenized in PBS containing 100 μm BHT and 100 μm DTPA using a Potter-Elvehjem tissue homogenizer with a PTFE pestle. Protein concentrations of lung tissue homogenate, cell pellet homogenates, and supernatants were determined using a Bradford-based Bio-Rad protein assay with IgG as the protein standard. 3-Chloro[13C6]tyrosine and 3-chloro[13C9 15N]tyrosine standards were prepared and isolated following exposure of eitherl-[13C6]tyrosine orl-[13C9 15N]tyrosine to HOCl (1:1, mol/mol) in 20 mm phosphoric acid as described (33MacPherson, J. C., Comhair, S. A. A., Erzurum, S. C., Klein, D. F., Lipscomb, M. F., Kavuru, M. S., Samoszuk, M. K., and Hazen, S. L. (2001) J. Immunol. 5763–5772Google Scholar). 3-Bromo[13C6]tyrosine and 3-bromo[13C9 15N]tyrosine standards were similarly synthesized by exposure of eitherl-[13C6]tyrosine orl-[13C9 15N]tyrosine to hypobromous acid (1:1, mol/mol) and isolation by preparative reverse phase HPLC (33MacPherson, J. C., Comhair, S. A. A., Erzurum, S. C., Klein, D. F., Lipscomb, M. F., Kavuru, M. S., Samoszuk, M. K., and Hazen, S. L. (2001) J. Immunol. 5763–5772Google Scholar). 3-Nitro[13C6]tyrosine and 3-nitro[13C9 15N1]tyrosine were synthesized by reaction of eitherl-[13C6]tyrosine orl-[13C9 15N1]tyrosine to ONOO− (1:1, mol/mol) and isolated as described (33MacPherson, J. C., Comhair, S. A. A., Erzurum, S. C., Klein, D. F., Lipscomb, M. F., Kavuru, M. S., Samoszuk, M. K., and Hazen, S. L. (2001) J. Immunol. 5763–5772Google Scholar). Protein was delipidated and desalted using two sequential extractions with a single phase mixture of H2O/methanol/H2O-saturated diethyl ether (1:3:8 v/v/v). Oxidized tyrosine standards (2 pmol each) and universal labeled tyrosine (2 nmol) were added to protein pellets. For nitrotyrosine analyses, proteins were hydrolyzed by incubating the desalted protein pellet with degassed 6N HCl supplemented with 1% phenol for 24 h under argon atmosphere. For chlorotyrosine and bromotyrosine analyses, samples were hydrolyzed in degassed 4N methane sulfonic acid supplemented with 1% phenol for 24 h at 100 °C under argon atmosphere. Amino acid hydrolysates were resuspended in Chelex-treated water and applied to mini solid-phase C18 extraction columns (Supelclean LC-C18SPE mini-column, 3 ml; Supelco, Inc., Bellefone, PA) pre-equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid. Following sequential washes with 2 ml of 0.1% trifluoroacetic acid, oxidized tyrosines and tyrosine were eluted with 2 ml of 30% methanol in 0.1% trifluoroacetic acid, dried under vacuum, and then analyzed by mass spectrometry as described below. For nitrotyrosine analyses, tandem mass spectrometry was performed using electrospray ionization and detection with an ion trap mass spectrometer (LCQ Deca, ThermoFinigann, San Jose, CA) interfaced with a Thermo SP4000 high performance liquid chromatograph (HPLC). Samples were suspended in equilibration solvent (H2O with 0.1% formic acid) and injected onto an Ultrasphere C18 column (Phenominex, 5 μm, 2.0 × 150 mm).l-Tyrosine and its oxidation products were eluted at a flow rate of 200 μl/min using a linear gradient generated against 0.1% formic acid in methanol, pH 2.5, as the second mobile phase. Analytes were monitored in positive ion mode with full scan product ion MS/MS at unit resolution. Response was optimized with a spray voltage setting of 5 kV and a spray current of 80 μA. The heated capillary voltage was set at 10 V and the temperature to 350 °C. Nitrogen was used both as sheath and auxiliary gas, at a flow rate of 70 and 30 arbitrary units, respectively. The precursor ion isolation width was 1.0 and 3.0 for nitrotyrosine and tyrosine, respectively. The analyte abundance was evaluated by measuring the chromatographic peak areas of selected product ions extracted from the full scan total ion chromatogram, according to the corresponding ion trap product ion spectra. The ions monitored for each analyte were: 3-nitro[12C6]tyrosine (mass-to-charge-ratio (m/z) 227→181, and 210); 3-nitro[13C6]tyrosine (m/z 233→187, and 216); 3-nitro[13C9 15N1]tyrosine (m/z 237→190, and 219); [12C6]tyrosine (m/z182→136, and 165); and [13C9 15N1]tyrosine (m/z 192→145, and 174). The maximum ion injection time was 200 ms; a scan rate was used that permitted a minimum sampling rate of at least 9 points/chromatographic peak. Tyrosine and nitrotyrosine were base line-resolved under the HPLC conditions employed, permitting programming of the LCQ Deca for analysis over a span of 0 to 7 min for detection of tyrosine isotopomers and from 7 min on for detection of 3-nitrotyrosine isotopomers. For 3-chlorotyrosine and 3-bromotyrosine analyses, gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) was performed after derivatization of amino acids to their n-propyl/heptafluorylbutyryl or n-propyl/pentafluorylpropionyl derivatives using a Finnigan Voyager GC/MS in the negative ion chemical ionization mode, as previously described (30Wu W. Samoszuk M.K. Comhair S.A.A. Thomassen M.J. Farver C.F. Dweik R.A. Kavuru M.S. Erzurum S.C. Hazen S.L. J. Clin. Invest. 2000; 105: 1455-1463Crossref PubMed Scopus (270) Google Scholar). For all analyses, results were normalized to the content of the precursor amino acid l-tyrosine, which was monitored within the same injection of each oxidized amino acid. Both 3-chlorotyrosine and 3-bromotyrosine were routinely detected a

Apolipoprotein E (apoE) is a major carrier of cholesterol and essential for synaptic plasticity. In brain, it's expressed by many cells but highly expressed by the choroid plexus and the predominant apolipoprotein in cerebrospinal fluid (CSF). The role of apoE in the CSF is unclear. Recently, the glymphatic system was described as a clearance system whereby CSF and ISF (interstitial fluid) is exchanged via the peri-arterial space and convective flow of ISF clearance is mediated by aquaporin 4 (AQP4), a water channel. We reasoned that this system also serves to distribute essential molecules in CSF into brain. The aim was to establish whether apoE in CSF, secreted by the choroid plexus, is distributed into brain, and whether this distribution pattern was altered by sleep deprivation.We used fluorescently labeled lipidated apoE isoforms, lenti-apoE3 delivered to the choroid plexus, immunohistochemistry to map apoE brain distribution, immunolabeled cells and proteins in brain, Western blot analysis and ELISA to determine apoE levels and radiolabeled molecules to quantify CSF inflow into brain and brain clearance in mice. Data were statistically analyzed using ANOVA or Student's t- test.We show that the glymphatic fluid transporting system contributes to the delivery of choroid plexus/CSF-derived human apoE to neurons. CSF-delivered human apoE entered brain via the perivascular space of penetrating arteries and flows radially around arteries, but not veins, in an isoform specific manner (apoE2 > apoE3 > apoE4). Flow of apoE around arteries was facilitated by AQP4, a characteristic feature of the glymphatic system. ApoE3, delivered by lentivirus to the choroid plexus and ependymal layer but not to the parenchymal cells, was present in the CSF, penetrating arteries and neurons. The inflow of CSF, which contains apoE, into brain and its clearance from the interstitium were severely suppressed by sleep deprivation compared to the sleep state.Thus, choroid plexus/CSF provides an additional source of apoE and the glymphatic fluid transporting system delivers it to brain via the periarterial space. By implication, failure in this essential physiological role of the glymphatic fluid flow and ISF clearance may also contribute to apoE isoform-specific disorders in the long term.

Abstract Accurate cannulation of the adrenal vein is challenging during adrenal venous sampling (AVS) because of the variations in adrenal vein anatomy. This study aimed to investigate the adrenal venous morphology in Chinese and improve the success rate of AVS. A total of 221 participants with primary aldosteronism (PA) who underwent AVS were enrolled. Compare the morphology among subgroups divided according to sex, body mass index (BMI), and with or without adenoma. The success rate of right, left, and bilateral AVS was 98.60%, 97.20%, and 96.85%, respectively. The triangular pattern was the most common (39.37%) on the right side, while the glandlike pattern (70.14%) on the left. The proportion of adrenal venous morphology varies among patients with different sexes ( χ 2 = 21.335, P < .001), BMI ( χ 2 = 10.642 P = .031), and with or without adenoma ( χ 2 = 10.637, P = .031) on the right side, and the male, obese and adenoma group showed a higher proportion of glandlike pattern than triangular pattern. If only dependent on computed tomography, 9.05% of patients incorrectly diagnose the dominant side, 14.48% of patients would have inappropriate surgery meanwhile 25.34% of patients would miss the surgical opportunity. In conclusion, the most common types of right and left adrenal venous morphology were triangular pattern and glandlike pattern, respectively. Sex, BMI, and the presence of adenoma affected right adrenal venous morphology. Adequate knowledge of the adrenal venous morphology is critical for improving the success rate of AVS and making an appropriate treatment for PA.

Abstract Background (Pro)renin receptors [(P)RR] binding both renin and its inactive proenzyme for prorenin induce increasing the efficiency of angiotensin I conversion and the production of angiotensin II (Ang II). Recently, (P)RR was reported to played a pathological role in diabetic renal disease independent of Ang II. Ang II is involved in lipid metabolism and atherosclerosis, but the (P)RR participation in atherosclerosis remains unclear. Thus, the objective of this study was to examine the relative importance of Ang II-independent actions of (P)RR and its mechanism in the development of atherosclerosis. Methods Clinical demographic characteristics and laboratory profile data of 1189 essential hypertensive were collected. Patients were divided into four groups based on the quartiles of plasma renin activity (PRA). The plasma lipoprotein levels of four groups were compared. Furthermore, we examined serum and liver lipoprotein levels, as well as ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) and ATP-binding cassette transporter G1 (ABCG1) expression in ApoE -/- mice treated with prorenin. ABCA1 and ABCG1 expression and their function in mediating cholesterol efflux were evaluated in THP-1 cells by prorenin treatment. Agonists of the peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) and liver X receptor α (LXRα) were used to investigate the mechanism involved in vitro. Results Plasma TC, TG, LDL-c, and apoB were significantly increased, and HDL-c and apoA were dramatically decreased with a trend of higher plasma renin activity (PRA) ( all P < 0.05) in hypertensive patients. Prorenin accelerated atherosclerosis by inhibiting mRNA and protein expression of ABCA1/ABCG1 in the liver of ApoE - / - mice. Prorenin binding to (P)RR inhibited the functions of ABCA1- and ABCG1-mediated cholesterol efflux. Furthermore, Prorenin reduced ABCA1/G1 expression of THP-1 cells through PPARγ/LXRα pathway. Conclusions (P)RR activated by prorenin inhibited the expression of ABCA1/ABCG1 through the PPARγ/LXRα pathway and the functions of ABCA1- and ABCG1-mediated cholesterol efflux, resulting in dyslipidemia and eventually atherosclerosis. Highlights With RPA increases in hypertension, plasma TC, TG, LDL-c, and apoB were higher, while HDL-c and apoA were lower. Prorenin binding to (P)RR accelerated atherosclerosis by inhibiting ABCA1/G1 expression and function. Prorenin reduced ABCA1/G1 expression of THP-1 cells through PPARγ/LXRα pathway.