Experiments using purified recombinant human NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1) revealed that the auto-oxidation of fully reduced protein resulted in a 1:1 stoichiometry of oxygen consumption to NADH oxidation with the production of hydrogen peroxide. The rate of auto-oxidation of fully reduced NQO1 was markedly accelerated in the presence of superoxide ( \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) ), whereas the addition of superoxide dismutase greatly inhibited the rate of auto-oxidation. The ability of reduced NQO1 to react with \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) suggested a role for NQO1 in scavenging \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) , and this hypothesis was tested using established methods for \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) production and detection. The addition of NQO1 in combination with NAD(P)H resulted in inhibition of dihydroethidium oxidation, pyrogallol auto-oxidation, and elimination of a potassium superoxide-generated ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) adduct signal (electron spin resonance). Kinetic parameters for the reduction of \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) by NQO1 were estimated using xanthine/xanthine oxidase as the source of \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) and after NQO1-dependent NADH oxidation at 340 nm. The ability of NQO1 to scavenge \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) was also examined using cell sonicates prepared from isogenic cell lines containing no NQO1 activity (NQO1^-) or very high levels of NQO1 activity (NQO1⁺). We demonstrated that addition of NAD(P)H and cell sonicate from NQO1⁺ but not NQO1^- cells resulted in an increased level of \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) scavenging could be inhibited by 5-methoxy-1,2-dimethyl-3-[(4-nitrophenoxy)methyl]indole-4,7-dione (ES936), a mechanism-based inhibitor of NQO1. NQO1 can generate hydroquinones that are redox active, and the \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) scavenging activity of NQO1 may allow protection against \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) at the site of hydroquinone generation. In addition, the \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) scavenging activity of NQO1 may provide an additional level of protection against \(\mathrm{O}_{2}^{{\bar{{\cdot}}}}\) induced toxicity.

Abstract Metastasis is the major cause of mortality for patients with cancer, and dysregulation of developmental signaling pathways can significantly contribute to the metastatic process. The Sine oculis homeobox homolog 1 (SIX1)/eyes absent (EYA) transcriptional complex plays a critical role in the development of multiple organs and is typically downregulated after development is complete. In breast cancer, aberrant expression of SIX1 has been demonstrated to stimulate metastasis through activation of TGFβ signaling and subsequent induction of epithelial–mesenchymal transition (EMT). In addition, SIX1 can induce metastasis via non-cell autonomous means, including activation of GLI-signaling in neighboring tumor cells and activation of VEGFC–induced lymphangiogenesis. Thus, targeting SIX1 would be expected to inhibit metastasis while conferring limited side effects. However, transcription factors are notoriously difficult to target, and thus novel approaches to inhibit their action must be taken. Here we identified a novel small molecule compound, NCGC00378430 (abbreviated as 8430), that reduces the SIX1/EYA2 interaction. 8430 partially reversed transcriptional and metabolic profiles mediated by SIX1 overexpression and reversed SIX1-induced TGFβ signaling and EMT. 8430 was well tolerated when delivered to mice and significantly suppressed breast cancer–associated metastasis in vivo without significantly altering primary tumor growth. Thus, we have demonstrated for the first time that pharmacologic inhibition of the SIX1/EYA2 complex and associated phenotypes is sufficient to suppress breast cancer metastasis. Significance: These findings identify and characterize a novel inhibitor of the SIX1/EYA2 complex that reverses EMT phenotypes suppressing breast cancer metastasis.