Periconceptional folate supplementation reduces the risk of neural-tube defects. We studied the frequency of the 677C-->T mutation in the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene in 55 patients with spina bifida and parents of such patients (70 mothers, 60 fathers). 5% of 207 controls were homozygous for the 677C-->T mutation compared with 16% of mothers, 10% of fathers, and 13% of patients. The mutation was associated with decreased MTHFR activity, low plasma folate, and high plasma homocysteine and red-cell folate concentrations. The 677C-->T mutation should be regarded as a genetic risk factor for spina bifida.

Countries worldwide recommend women planning pregnancy to use daily 400 microg of synthetic folic acid in the periconceptional period to prevent birth defects in children. The underlying mechanisms of this preventive effect are not clear, however, epigenetic modulation of growth processes by folic acid is hypothesized. Here, we investigated whether periconceptional maternal folic acid use and markers of global DNA methylation potential (S-adenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine blood levels) in mothers and children affect methylation of the insulin-like growth factor 2 gene differentially methylation region (IGF2 DMR) in the child. Moreover, we tested whether the methylation of the IGF2 DMR was independently associated with birth weight.IGF2 DMR methylation in 120 children aged 17 months (SD 0.3) of whom 86 mothers had used and 34 had not used folic acid periconceptionally were studied. Methylation was measured of 5 CpG dinucleotides covering the DMR using a mass spectrometry-based method. Children of mother who used folic acid had a 4.5% higher methylation of the IGF2 DMR than children who were not exposed to folic acid (49.5% vs. 47.4%; p = 0.014). IGF2 DMR methylation of the children also was associated with the S-adenosylmethionine blood level of the mother but not of the child (+1.7% methylation per SD S-adenosylmethionine; p = 0.037). Finally, we observed an inverse independent association between IGF2 DMR methylation and birth weight (-1.7% methylation per SD birthweight; p = 0.034).Periconceptional folic acid use is associated with epigenetic changes in IGF2 in the child that may affect intrauterine programming of growth and development with consequences for health and disease throughout life. These results indicate plasticity of IGF2 methylation by periconceptional folic acid use.

We conducted a genome-wide association study for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) in 401 affected individuals and 1,323 controls, with replication in an independent sample of 793 NSCL/P triads. We report two new loci associated with NSCL/P at 17q22 (rs227731, combined P = 1.07 x 10(-8), relative risk in homozygotes = 1.84, 95% CI 1.34-2.53) and 10q25.3 (rs7078160, combined P = 1.92 x 10(-8), relative risk in homozygotes = 2.17, 95% CI 1.32-3.56).

Previously we have shown that nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) is strongly associated with SNPs in IRF6 (interferon regulatory factor 6). Here, we use multispecies sequence comparisons to identify a common SNP (rs642961, G>A) in a newly identified IRF6 enhancer. The A allele is significantly overtransmitted (P = 1 x 10(-11)) in families with NSCL/P, in particular those with cleft lip but not cleft palate. Further, there is a dosage effect of the A allele, with a relative risk for cleft lip of 1.68 for the AG genotype and 2.40 for the AA genotype. EMSA and ChIP assays demonstrate that the risk allele disrupts the binding site of transcription factor AP-2alpha and expression analysis in the mouse localizes the enhancer activity to craniofacial and limb structures. Our findings place IRF6 and AP-2alpha in the same developmental pathway and identify a high-frequency variant in a regulatory element contributing substantially to a common, complex disorder.

The maternal vitamin status, especially of folate, is involved in the pathogenesis of neural-tube defects (NTDs). Maternal folate administration can prevent these malformations. The precise metabolic mechanism of the beneficial effect of folate is unclear. In this study we focus on homocysteine accumulation, which may derive from abnormalities of metabolism of folate, vitamin B12, and vitamin B6. We studied nonpregnant women, 41 of whom had given birth to infants with NTDs and 50 control women who previously had normal offspring. The determinations included the plasma total homocysteine both in the fasting state and 6 hours after the ingestion of a methionine load. In addition, we measured the fasting blood levels of folate, vitamin B12, and vitamin B6. The mean values for both basal homocysteine and homocysteine following a methionine load were significantly increased in the group of women who previously had infants with NTDs. In nine of these subjects and two controls, the values after methionine ingestion exceeded the mean control by more than 2 standard deviations. Cystathionine synthase levels in skin fibroblasts derived from these methionine-intolerant women were within the normal range. Our findings suggest a disorder in the remethylation of homocysteine to methionine due to an acquired (ie, nutritional) or inherited derangement of folate or vitamin B12 metabolism. Increased homocysteine levels can be normalized by administration of vitamin B6 or folate. Therefore, we suggest that the prevention of NTDs by periconceptional folate administration may effectively correct a mild to moderate hyperhomocysteinemia.

Objective: To study the effects of folic acid and zinc sulfate treatment on semen variables in fertile and subfertile men.Design: Double-blind, placebo-controlled interventional study.Setting: Two outpatient fertility clinics and nine midwifery practices in The Netherlands.Participant(s): One hundred eight fertile and 103 subfertile men.Intervention(s): Both groups were randomly assigned to receive one of four treatments for 26 weeks: folic acid and placebo, zinc sulfate and placebo, zinc sulfate and folic acid, and two placebos. Folic acid was given at a daily dose of 5 mg, and zinc sulfate was given at a daily dose of 66 mg.Main Outcome Measure(s): Before and after treatment, standardized semen and blood samples were obtained for determinations of sperm concentration, motility, and morphology according to World Health Organization guidelines; semen morphology according to strict criteria; and blood folate and zinc concentrations. Effects of the four interventions were evaluated separately in subfertile and fertile men.Result(s): Subfertile men demonstrated a significant 74% increase in total normal sperm count and a minor increase of 4% abnormal spermatozoa. A similar trend was observed in fertile men. Preintervention concentrations of folate and zinc in blood and seminal plasma did not significantly differ between fertile and subfertile men.Conclusion(s): Total normal sperm count increases after combined zinc sulfate and folic acid treatment in both subfertile and fertile men. Although the beneficial effect on fertility remains to be established, this finding opens avenues of future fertility research and treatment and may affect public health.

Please cite this paper as: Bergen N, Jaddoe V, Timmermans S, Hofman A, Lindemans J, Russcher H, Raat H, Steegers‐Theunissen R, Steegers E. Homocysteine and folate concentrations in early pregnancy and the risk of adverse pregnancy outcomes: the Generation R Study. BJOG 2012;119:739–751. Objective To investigate associations between early pregnancy homocysteine, folate and vitamin B12 concentrations and placental weight, birthweight and adverse pregnancy outcomes. Design Population‐based birth cohort study. Setting Rotterdam, the Netherlands. Population Cohort of 5805 pregnant women. Methods To analyse homocysteine, folate and vitamin B12 concentrations, blood was drawn in early pregnancy. These concentrations were divided into quintiles. Information on birth outcomes was retrieved from medical records. Multivariate regression analyses were used. Main outcome measures Placental weight, birthweight, small for gestational age at birth (SGA) (<5th centile), prematurity and pre‐eclampsia. Results High homocysteine concentrations (highest quintile) were associated with lower placental weight (difference 30 g; P < 0.001) and birthweight (difference 110 g; P < 0.001), and increased risk of SGA [odds ratio (OR) 1.7; P = 0.006] compared with lowest quintile (reference). Low folate concentrations (lowest quintile) were associated with lower placental weight (difference 26 g; P = 0.001) and birthweight (difference 125 g; P < 0.001), and increased risks of SGA (OR 1.9; P = 0.002), prematurity (OR 2.2; P = 0.002) and pre‐eclampsia (OR 2.1; P = 0.04) compared with highest quintile (reference). The risk of developing SGA and pre‐eclampsia was substantially higher in women who had higher homocysteine and lower folate concentrations. No associations were found with vitamin B12. Conclusions Higher homocysteine and lower folate concentrations in early pregnancy are associated with lower placental weight and birthweight, and higher risk of adverse pregnancy outcomes. These findings suggest that high homocysteine and low folate concentrations in early pregnancy may adversely influence placentation and subsequently affect the success of pregnancy and birth outcomes.

Objective: We aimed to validate a food-frequency questionnaire (FFQ) for Dutch pregnant women, against three 24 h-recalls and blood concentrations of B-vitamins and fatty acids, using the method of triads. Methods: We included 83 pregnant women from the general population of Rotterdam, the Netherlands, at a median gestational age of 15.6 weeks. Participants completed three non-consecutive 24 h-recalls, and subsequently filled out the 293-item FFQ. Participants provided blood samples from which we analyzed serum folate and vitamin B12, as well as red blood cell folate, linoleic acid, and total saturated, monounsaturated, and polyunsaturated fatty acids. Results: Estimated energy intake did not differ between the FFQ and 24 h-recalls. Deattenuated Pearson’s correlation coefficients, between energy-adjusted nutrient intake estimates from the FFQ and the 24 h-recalls, ranged from 0.41 (fat) to 0.88 (fiber) for macronutrients, and were around 0.6 for most micronutrients, except for vitamin E (0.27). Using the triad method, we obtained validity coefficients of 0.86 (95% Confidence Interval (CI) 0.36, 1.00) for serum folate, 0.86 (95% CI 0.18, 1.00) for red blood cell folate, and 1.00 (95% CI 0.42, 1.00) for vitamin B12. Validity coefficients for serum fatty acids ranged from 0.22 to 0.67. Conclusion: This FFQ is a reliable tool for estimating intake of energy, macronutrients, folate and vitamin B12 among women in mid-pregnancy.

Introduction Maternal obesity poses risks for both mother and offspring during pregnancy, with underlying mechanisms remaining largely unexplored. Obesity is associated with microbial gut dysbiosis and low-grade inflammation, and also the diet has a major impact on these parameters. This study aimed to investigate how maternal obesity and diet contribute to changes in immune responses, exploring potential associations with gut microbiota dysbiosis and adverse pregnancy outcomes in mice. Methods Before mating, C57BL/6 mice were assigned to either a high-fat-diet (HFD) or low-fat-diet (LFD) to obtain obese (n=17) and lean (n=10) mice. To distinguish between the effects of obesity and diet, 7 obese mice were switched from the HFD to the LFD from day 7 until day 18 of pregnancy (“switch group”), which was the endpoint of the study. T helper (Th) cell subsets were studied in the spleen, mesenteric lymph nodes (MLN) and Peyer’s patches (PP), while monocyte subsets and activation status were determined in maternal blood (flow cytometry). Feces were collected before and during pregnancy (day 7,14,18) for microbiota analysis (16S rRNA sequencing). Pregnancy outcome included determination of fetal and placental weight. Results Obesity increased splenic Th1 and regulatory T cells, MLN Th1 and PP Th17 cells and enhanced IFN-γ and IL-17A production by splenic Th cells upon ex vivo stimulation. Switching diet decreased splenic and PP Th2 cells and classical monocytes, increased intermediate monocytes and activation of intermediate/nonclassical monocytes. Obesity and diet independently induced changes in the gut microbiota. Various bacterial genera were increased or decreased by obesity or the diet switch. These changes correlated with the immunological changes. Fetal weight was lower in the obese than the lean group, while placental weight was lower in the switch than the obese group. Discussion This study demonstrates that obesity and diet independently impact peripheral and intestinal immune responses at the end of pregnancy. Simultaneously, both factors affect specific bacterial gut genera and lead to reduced fetal or placental weight. Our data suggest that switching diet during pregnancy to improve maternal health is not advisable and it supports pre/probiotic treatment of maternal obesity-induced gut dysbiosis to improve maternal immune responses and pregnancy outcome.