Excess lipid accumulation in non-adipose tissues is associated with insulin resistance, pancreatic β-cell apoptosis and heart failure. Here, we demonstrate in cultured cells that the relative toxicity of two common dietary long chain fatty acids is related to channeling of these lipids to distinct cellular metabolic fates. Oleic acid supplementation leads to triglyceride accumulation and is well tolerated, whereas excess palmitic acid is poorly incorporated into triglyceride and causes apoptosis. Unsaturated fatty acids rescue palmitate-induced apoptosis by channeling palmitate into triglyceride pools and away from pathways leading to apoptosis. Moreover, in the setting of impaired triglyceride synthesis, oleate induces lipotoxicity. Our findings support a model of cellular lipid metabolism in which unsaturated fatty acids serve a protective function against lipotoxicity though promotion of triglyceride accumulation.

Recent evidence has defined an important role for PPARα in the transcriptional control of cardiac energy metabolism. To investigate the role of PPARα in the genesis of the metabolic and functional derangements of diabetic cardiomyopathy, mice with cardiac-restricted overexpression of PPARα (MHC-PPAR) were produced and characterized. The expression of PPARα target genes involved in cardiac fatty acid uptake and oxidation pathways was increased in MHC-PPAR mice. Surprisingly, the expression of genes involved in glucose transport and utilization was reciprocally repressed in MHC-PPAR hearts. Consistent with the gene expression profile, myocardial fatty acid oxidation rates were increased and glucose uptake and oxidation decreased in MHC-PPAR mice, a metabolic phenotype strikingly similar to that of the diabetic heart. MHC-PPAR hearts exhibited signatures of diabetic cardiomyopathy including ventricular hypertrophy, activation of gene markers of pathologic hypertrophic growth, and transgene expression–dependent alteration in systolic ventricular dysfunction. These results demonstrate that (a) PPARα is a critical regulator of myocardial fatty acid uptake and utilization, (b) activation of cardiac PPARα regulatory pathways results in a reciprocal repression of glucose uptake and utilization pathways, and (c) derangements in myocardial energy metabolism typical of the diabetic heart can become maladaptive, leading to cardiomyopathy.

Recent evidence has defined an important role for PPARα in the transcriptional control of cardiac energy metabolism. To investigate the role of PPARα in the genesis of the metabolic and functional derangements of diabetic cardiomyopathy, mice with cardiac-restricted overexpression of PPARα (MHC-PPAR) were produced and characterized. The expression of PPARα target genes involved in cardiac fatty acid uptake and oxidation pathways was increased in MHC-PPAR mice. Surprisingly, the expression of genes involved in glucose transport and utilization was reciprocally repressed in MHC-PPAR hearts. Consistent with the gene expression profile, myocardial fatty acid oxidation rates were increased and glucose uptake and oxidation decreased in MHC-PPAR mice, a metabolic phenotype strikingly similar to that of the diabetic heart. MHC-PPAR hearts exhibited signatures of diabetic cardiomyopathy including ventricular hypertrophy, activation of gene markers of pathologic hypertrophic growth, and transgene expression–dependent alteration in systolic ventricular dysfunction. These results demonstrate that (a) PPARα is a critical regulator of myocardial fatty acid uptake and utilization, (b) activation of cardiac PPARα regulatory pathways results in a reciprocal repression of glucose uptake and utilization pathways, and (c) derangements in myocardial energy metabolism typical of the diabetic heart can become maladaptive, leading to cardiomyopathy.

Abstract In addition to pathology in the gray matter, there are also abnormalities in the white matter in Alzheimer's disease (AD). Sulfatide species are a class of myelin‐specific sphingolipids and are involved in certain diseases of the central nervous system. To assess whether sulfatide content in gray and white matter in human subjects is associated with both the presence of Alzheimer's disease (AD) pathology as well as the stage of dementia, we analyzed the sulfatide content of brain tissue lipid extracts by electrospray ionization mass spectrometry from 22 subjects whose cognitive status at time of death varied from no dementia to very severe dementia. All subjects with dementia had AD pathology. The results demonstrate that: (i) sulfatides were depleted up to 93% in gray matter and up to 58% in white matter from all examined brain regions from AD subjects with very mild dementia, whereas all other major classes of lipid (except plasmalogen) in these subjects were not altered in comparison to those from age‐matched subjects with no dementia; (ii) there was no apparent deficiency in the biosynthesis of sulfatides in very mild AD subjects as characterized by the examination of galactocerebroside sulfotransferase activities in post‐mortem brain tissues; (iii) the content of ceramides (a class of potential degradation products of sulfatides) was elevated more than three‐fold in white matter and peaked at the stage of very mild dementia. The findings demonstrate that a marked decrease in sulfatides is associated with AD pathology even in subjects with very mild dementia and that these changes may be linked with early events in the pathological process of AD.

Cell dysfunction and death induced by lipid accumulation in nonadipose tissues, or lipotoxicity, may contribute to the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes. However, the mechanisms leading to lipotoxic cell death are poorly understood. We recently reported that, in Chinese hamster ovary (CHO) cells and in H9c2 cardiomyoblasts, lipid overload induced by incubation with 500 μM palmitate leads to intracellular accumulation of reactive oxygen species, which subsequently induce endoplasmic reticulum (ER) stress and cell death. Here, we show that palmitate also impairs ER function through a more direct mechanism. Palmitate was rapidly incorporated into saturated phospholipid and triglyceride species in microsomal membranes of CHO cells. The resulting membrane remodeling was associated with dramatic dilatation of the ER and redistribution of protein-folding chaperones to the cytosol within 5 h, indicating compromised ER membrane integrity. Increasing β-oxidation, through the activation of AMP-activated protein kinase, decreased palmitate incorporation into microsomes, decreased the escape of chaperones to the cytosol, and decreased subsequent caspase activation and cell death. Thus, palmitate rapidly increases the saturated lipid content of the ER, leading to compromised ER morphology and integrity, suggesting that impairment of the structure and function of this organelle is involved in the cellular response to fatty acid overload. Cell dysfunction and death induced by lipid accumulation in nonadipose tissues, or lipotoxicity, may contribute to the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes. However, the mechanisms leading to lipotoxic cell death are poorly understood. We recently reported that, in Chinese hamster ovary (CHO) cells and in H9c2 cardiomyoblasts, lipid overload induced by incubation with 500 μM palmitate leads to intracellular accumulation of reactive oxygen species, which subsequently induce endoplasmic reticulum (ER) stress and cell death. Here, we show that palmitate also impairs ER function through a more direct mechanism. Palmitate was rapidly incorporated into saturated phospholipid and triglyceride species in microsomal membranes of CHO cells. The resulting membrane remodeling was associated with dramatic dilatation of the ER and redistribution of protein-folding chaperones to the cytosol within 5 h, indicating compromised ER membrane integrity. Increasing β-oxidation, through the activation of AMP-activated protein kinase, decreased palmitate incorporation into microsomes, decreased the escape of chaperones to the cytosol, and decreased subsequent caspase activation and cell death. Thus, palmitate rapidly increases the saturated lipid content of the ER, leading to compromised ER morphology and integrity, suggesting that impairment of the structure and function of this organelle is involved in the cellular response to fatty acid overload. Increased serum triacylglycerol (TAG) and NEFA levels, associated with obesity and type 2 diabetes, contribute to lipid accumulation in many nonadipose tissues. Through the process of lipotoxicity, this inappropriate accumulation of excess lipid can lead to cellular dysfunction and cell death (1Unger R.H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome.Trends Endocrinol. Metab. 2003; 14: 398-403Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (325) Google Scholar). For example, evidence from rodent models strongly implicates cardiac accumulation of lipid in the genesis of heart failure in diabetes. TAG accumulation in cardiomyocytes of leptin- or leptin receptor-deficient obese diabetic animal models is associated with cardiomyocyte apoptosis (2Zhou Y.T. Grayburn P. Karim A. Shimabukuro M. Higa M. Baetens D. Orci L. Unger R.H. Lipotoxic heart disease in obese rats: implications for human obesity.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 1784-1789Crossref PubMed Scopus (1067) Google Scholar) and contractile dysfunction (2Zhou Y.T. Grayburn P. Karim A. Shimabukuro M. Higa M. Baetens D. Orci L. Unger R.H. Lipotoxic heart disease in obese rats: implications for human obesity.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 1784-1789Crossref PubMed Scopus (1067) Google Scholar, 3Aasum E. Belke D.D. Severson D.L. Riemersma R.A. Cooper M. Andreassen M. Larsen T.S. Cardiac function and metabolism in type 2 diabetic mice after treatment with BM 17.0744, a novel PPAR-alpha activator.Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2002; 283: H949-H957Crossref PubMed Scopus (143) Google Scholar, 4Christoffersen C. Bollano E. Lindegaard M.L. Bartels E.D. Goetze J.P. Andersen C.B. Nielsen L.B. Cardiac lipid accumulation associated with diastolic dysfunction in obese mice.Endocrinology. 2003; 144: 3483-3490Crossref PubMed Scopus (293) Google Scholar). Consistent with this apparent cardiac lipotoxicity, cardiomyocyte-specific increases in FA uptake in mice with cardiac-restricted overexpression of long-chain acyl-CoA synthetase 1, lipoprotein lipase, or fatty acid transport protein 1 are sufficient to cause cardiomyocyte dysfunction and/or death that lead to left ventricular dysfunction (5Chiu H.C. Kovacs A. Ford D.A. Hsu F.F. Garcia R. Herrero P. Saffitz J.E. Schaffer J.E. A novel mouse model of lipotoxic cardiomyopathy.J. Clin. Invest. 2001; 107: 813-822Crossref PubMed Scopus (612) Google Scholar, 6Yagyu H. Chen G. Yokoyama M. Hirata K. Augustus A. Kako Y. Seo T. Hu Y. Lutz E.P. Merkel M. et al.Lipoprotein lipase (LpL) on the surface of cardiomyocytes increases lipid uptake and produces a cardiomyopathy.J. Clin. Invest. 2003; 111: 419-426Crossref PubMed Scopus (296) Google Scholar, 7Chiu H.C. Kovacs A. Blanton R.M. Han X. Courtois M. Weinheimer C.J. Yamada K.A. Brunet S. Xu H. Nerbonne J.M. et al.Transgenic expression of fatty acid transport protein 1 in the heart causes lipotoxic cardiomyopathy.Circ. Res. 2005; 96: 225-233Crossref PubMed Scopus (346) Google Scholar). Studies using cultured cells to model the lipotoxic response have helped elucidate the mechanisms involved in the response to FA overload. Long-chain saturated fatty acids, such as palmitate, induce cell death in a variety of cell types, including cardiomyocytes (8Borradaile N.M. Schaffer J.E. Lipotoxicity in the heart.Curr. Hypertens. Rep. 2005; 7: 412-417Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). In general, palmitate-induced cell death is characterized by markers of apoptosis, including cytochrome c release, caspase activation, and DNA fragmentation. Although relatively few studies have focused on mechanisms of palmitate-induced cell death in cardiomyocytes, recent evidence obtained using primary cardiomyocyte cultures from embryonic chicks and neonatal rats suggests that incubation with palmitate is associated with the loss of mitochondrial membrane potential, mitochondrial swelling, and cytochrome c release (9Sparagna G.C. Hickson-Bick D.L. Buja L.M. McMillin J.B. A metabolic role for mitochondria in palmitate-induced cardiac myocyte apoptosis.Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000; 279: H2124-H2132Crossref PubMed Google Scholar, 10Kong J.Y. Rabkin S.W. Palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes is mediated through alterations in mitochondria: prevention by cyclosporin A.Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1485: 45-55Crossref PubMed Scopus (110) Google Scholar, 11Ostrander D.B. Sparagna G.C. Amoscato A.A. McMillin J.B. Dowhan W. Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome c release in palmitate-induced cardiomyocyte apoptosis.J. Biol. Chem. 2001; 276: 38061-38067Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (78) Google Scholar). These events may be initiated via several mechanisms, including decreased synthesis of the signature mitochondrial membrane phospholipid, cardiolipin (11Ostrander D.B. Sparagna G.C. Amoscato A.A. McMillin J.B. Dowhan W. Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome c release in palmitate-induced cardiomyocyte apoptosis.J. Biol. Chem. 2001; 276: 38061-38067Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (78) Google Scholar), increased ceramide synthesis (9Sparagna G.C. Hickson-Bick D.L. Buja L.M. McMillin J.B. A metabolic role for mitochondria in palmitate-induced cardiac myocyte apoptosis.Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000; 279: H2124-H2132Crossref PubMed Google Scholar, 12Dyntar D. Eppenberger-Eberhardt M. Maedler K. Pruschy M. Eppenberger H.M. Spinas G.A. Donath M.Y. Glucose and palmitic acid induce degeneration of myofibrils and modulate apoptosis in rat adult cardiomyocytes.Diabetes. 2001; 50: 2105-2113Crossref PubMed Scopus (170) Google Scholar), and increased generation of reactive oxygen species (ROS) (13Listenberger L.L. Ory D.S. Schaffer J.E. Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway.J. Biol. Chem. 2001; 276: 14890-14895Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (481) Google Scholar, 14Borradaile N.M. Buhman K.K. Listenberger L.L. Magee C.J. Morimoto E.T. Ory D.S. Schaffer J.E. A critical role for eukaryotic elongation factor 1A-1 in lipotoxic cell death.Mol. Biol. Cell. 2006; 17: 770-778Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). However, the induction of apoptosis by both ceramide and oxidative stress requires a flux of calcium ions from the endoplasmic reticulum (ER) to the mitochondria (15Demaurex N. Distelhorst C. Cell biology. Apoptosis—the calcium connection.Science. 2003; 300: 65-67Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar, 16Scorrano L. Oakes S.A. Opferman J.T. Cheng E.H. Sorcinelli M.D. Pozzan T. Korsmeyer S.J. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: a control point for apoptosis.Science. 2003; 300: 135-139Crossref PubMed Scopus (1223) Google Scholar), and depletion of these calcium stores can impair normal protein-folding functions, leading to ER stress (17Rao R.V. Ellerby H.M. Bredesen D.E. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Cell Death Differ. 2004; 11: 372-380Crossref PubMed Scopus (815) Google Scholar, 18Rutkowski D.T. Kaufman R.J. A trip to the ER: coping with stress.Trends Cell Biol. 2004; 14: 20-28Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1178) Google Scholar). Consistent with this concept, we and others recently showed that palmitate overload rapidly induces ER stress in pancreatic β-cells (19Kharroubi I. Ladriere L. Cardozo A.K. Dogusan Z. Cnop M. Eizirik D.L. Free fatty acids and cytokines induce pancreatic beta-cell apoptosis by different mechanisms: role of nuclear factor-kappaB and endoplasmic reticulum stress.Endocrinology. 2004; 145: 5087-5096Crossref PubMed Scopus (498) Google Scholar), hepatocytes (20Wei Y. Wang D. Topczewski F. Pagliassotti M.J. Saturated fatty acids induce endoplasmic reticulum stress and apoptosis independently of ceramide in liver cells.Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2006; 291: E275-E281Crossref PubMed Scopus (555) Google Scholar), and cardiomyoblasts (14Borradaile N.M. Buhman K.K. Listenberger L.L. Magee C.J. Morimoto E.T. Ory D.S. Schaffer J.E. A critical role for eukaryotic elongation factor 1A-1 in lipotoxic cell death.Mol. Biol. Cell. 2006; 17: 770-778Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). Furthermore, our studies revealed that palmitate-induced ER stress was mediated, in part, through the generation of ROS (14Borradaile N.M. Buhman K.K. Listenberger L.L. Magee C.J. Morimoto E.T. Ory D.S. Schaffer J.E. A critical role for eukaryotic elongation factor 1A-1 in lipotoxic cell death.Mol. Biol. Cell. 2006; 17: 770-778Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). Several observations indicate that palmitate may also act more directly at the level of the ER to initiate a lipotoxic response. In vitro evidence suggests that palmitoyl-CoA facilitates ER fission (21Turner M.D. Fatty acyl CoA-mediated inhibition of endoplasmic reticulum assembly.Biochim. Biophys. Acta. 2004; 1693: 1-4Crossref PubMed Scopus (14) Google Scholar) and that the acyl chains of lipids directly affect the fusion/fission events of membranes (22Kozlovsky Y. Chernomordik L.V. Kozlov M.M. Lipid intermediates in membrane fusion: formation, structure, and decay of hemifusion diaphragm.Biophys. J. 2002; 83: 2634-2651Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (212) Google Scholar, 23Haque M.E. Lentz B.R. Roles of curvature and hydrophobic interstice energy in fusion: studies of lipid perturbant effects.Biochemistry. 2004; 43: 3507-3517Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar). Furthermore, incorporation of saturated fatty acyl chains into membrane phospholipids can induce detrimental stiffening of cellular membranes (24Rintoul D.A. Sklar L.A. Simoni R.D. Membrane lipid modification of Chinese hamster ovary cells. Thermal properties of membrane phospholipids.J. Biol. Chem. 1978; 253: 7447-7452Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 25Schroeder F. Goh E.H. Effect of fatty acids on physical properties of microsomes from isolated perfused rat liver.Chem. Phys. Lipids. 1980; 26: 207-224Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar, 26Spector A.A. Yorek M.A. Membrane lipid composition and cellular function.J. Lipid Res. 1985; 26: 1015-1035Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Here, we demonstrate that, in CHO cells and H9c2 cardiomyoblasts, the rapid induction of ER stress in the presence of palmitate is associated with the rapid incorporation of this fatty acid into lipid components of the rough ER and subsequent compromise of rough ER structure and integrity. Although previous studies indicate that palmitate-induced intracellular responses converge on the mitochondria, eventually resulting in the release of cytochrome c into the cytosol and apoptotic cell death, our studies suggest that the ER may play an important proximal role in FA-induced cytotoxicity. CHO-K1 (CHO) cells (American Type Culture Collection) and stearoyl-coenzyme A desaturase 1 (SCD1)-overexpressing CHO cells (27Listenberger L.L. Han X. Lewis S.E. Cases S. Farese Jr., R.V. Ory D.S. Schaffer J.E. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 3077-3082Crossref PubMed Scopus (1381) Google Scholar) were maintained in high-glucose (4.5 mg/ml) DMEM and Ham's F-12 nutrient mixture (1:1), with 5% FBS, as described (27Listenberger L.L. Han X. Lewis S.E. Cases S. Farese Jr., R.V. Ory D.S. Schaffer J.E. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 3077-3082Crossref PubMed Scopus (1381) Google Scholar). H9c2 rat cardiomyoblasts (American Type Culture Collection) were maintained in high-glucose DMEM with 10% FBS, as described (14Borradaile N.M. Buhman K.K. Listenberger L.L. Magee C.J. Morimoto E.T. Ory D.S. Schaffer J.E. A critical role for eukaryotic elongation factor 1A-1 in lipotoxic cell death.Mol. Biol. Cell. 2006; 17: 770-778Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). For experiments, all CHO and H9c2 cell lines (90% confluent) were incubated in CHO cell growth medium supplemented with palmitate (500 μM) or oleate (500 μM) (Nu-Chek Prep) complexed to BSA at a 2:1 molar ratio, prepared as described previously (13Listenberger L.L. Ory D.S. Schaffer J.E. Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway.J. Biol. Chem. 2001; 276: 14890-14895Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (481) Google Scholar). 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-4-ribofuranoside (AICAr) was from Calbiochem; etomoxir, H2O2, α-tocopherol (vitamin E), thapsigargin, and DMSO were from Sigma. CHO cells were incubated for 1 h with [9,10-3H]palmitate (Perkin-Elmer), [9,10-3H]oleate (Perkin-Elmer), or [9,10-3H]2-bromopalmitate (American Radiochemicals) at a specific activity of 10 μCi/mmol. Crude mitochondria, cytosol, smooth microsomes, and rough microsomes were isolated by homogenization and sequential centrifugation, as described previously (28Nigam S.K. Blobel G. Cyclic AMP-dependent protein kinase in canine pancreatic rough endoplasmic reticulum.J. Biol. Chem. 1989; 264: 16927-16932Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Radioactivity in each fraction was measured using a Beckman LS 6000IC scintillation counter and normalized to the total protein in each fraction (BCA Protein Assay; Pierce). The relative purity of the isolated fractions was assessed by immunoblotting using rabbit polyclonal antibodies against histone H1 (Stressgen), long-chain acyl-CoA dehydrogenase [a gift from A. Strauss (29Hainline B.E. Kahlenbeck D.J. Grant J. Strauss A.W. Tissue specific and developmental expression of rat long- and medium-chain acyl-CoA dehydrogenases.Biochim. Biophys. Acta. 1993; 1216: 460-468Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar)], and p63 [a gift from J. Rohrer (30Schweizer A. Rohrer J. Slot J.W. Geuze H.J. Kornfeld S. Reassessment of the subcellular localization of p63.J. Cell Sci. 1995; 108: 2477-2485PubMed Google Scholar)]. CHO cells were incubated for 1 h in the absence or presence of 500 μM [7,7,8,8-2H]palmitate (Cambridge Isotope). Rough microsomes were isolated as described above. Lipids were extracted and lipid species were identified and quantitated by electrospray ionization mass spectrometry (31Han X. Gross R.W. Shotgun lipidomics: multidimensional MS analysis of cellular lipidomes.Expert Rev. Proteomics. 2005; 2: 253-264Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar, 32Han X. Gross R.W. Shotgun lipidomics: electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples.Mass Spectrom. Rev. 2005; 24: 367-412Crossref PubMed Scopus (907) Google Scholar). The mass levels of phosphatidylethanolamine were not determined in this study. CHO cells were harvested, fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer, postfixed in 1.25% osmium tetroxide, and stained with 4% aqueous uranyl acetate. Embedded tissue was then thin-sectioned and viewed on a Zeiss 902 electron microscope. Glutaraldehyde, osmium tetroxide, and uranyl acetate were from Electron Microscopy Sciences. Crude cytosolic and membrane/organelle fractions were isolated from CHO cells by sequential detergent extraction using ProteoExtract reagents from Calbiochem (33Abdolzade-Bavil A. Hayes S. Goretzki L. Kroger M. Anders J. Hendriks R. Convenient and versatile subcellular extraction procedure, that facilitates classical protein expression profiling and functional protein analysis.Proteomics. 2004; 4: 1397-1405Crossref PubMed Scopus (67) Google Scholar). Based on our preliminary assessment of the distribution of marker proteins, an alternative method of homogenization and sequential centrifugation (34Nigam S.K. Goldberg A.L. Ho S. Rohde M.F. Bush K.T. Sherman M. A set of endoplasmic reticulum proteins possessing properties of molecular chaperones includes Ca(2+)-binding proteins and members of the thioredoxin superfamily.J. Biol. Chem. 1994; 269: 1744-1749Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) was required to isolate cytosolic and crude microsomal fractions from H9c2 cells. Glucose-regulated protein 78 (GRP78) and protein disulfide isomerase (PDI) in 7.5–20 μg of protein from each subcellular fraction were detected using rabbit polyclonal antibodies (Stressgen). Cytochrome c in 40–80 μg of protein from crude mitochondrial and cytosolic fractions, isolated by sequential centrifugation, was detected using a monoclonal antibody (BD Biosciences). Palmitate-induced depletion of thapsigargin-sensitive calcium stores was assessed using the Fluo-4 NW calcium assay kit (Molecular Probes, Invitrogen) in a 96-well plate format, according to the manufacturer's protocol. After incubation with palmitate, cells were loaded with Fluo-4 AM in the presence of 2.5 mM probenicid. Thapsigargin (1 μM) or vehicle (DMSO) was added immediately, and fluorescence at 2 min was measured using a Hidex plate reader (excitation at 485 nm and emission at 535 nm). Data were expressed as fluorescent increments (change in fluorescence) upon addition of thapsigargin. Depolarization of mitochondria was assessed using the potential-dependent dye, JC-1 (Molecular Probes, Invitrogen). CHO cells incubated for up to 5 h with 500 μM palmitate or 2.5 mM H2O2 were stained with 7.5 μM JC-1 at 37°C, according to the manufacturer's protocol. Mean red and green fluorescence were determined by flow cytometry (104 cells/sample) for subsequent calculation of mean FL2/FL1 ratios. The presence of intact mitochondria was assessed using MitoTracker Green FM (Molecular Probes, Invitrogen). CHO cells incubated for up to 18 h with 500 μM palmitate or 2.5 mM H2O2 were stained for 30 min with 20 nM MitoTracker Green FM at 37°C, according to the manufacturer's protocol. Mean fluorescence was determined by flow cytometry (104 cells/sample). Activation of caspases-3 and -7 was determined by immunoblotting of cytosolic (40 μg of protein) and microsomal (70 μg of protein) fractions from H9c2 cells incubated for up to 24 h with various treatments. Rabbit polyclonal antibodies were used to simultaneously detect both pro- (inactive) and cleaved (active) forms of each caspase (Cell Signaling Technologies). Cell death was assessed by membrane permeability to propidium iodide, as described previously (13Listenberger L.L. Ory D.S. Schaffer J.E. Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway.J. Biol. Chem. 2001; 276: 14890-14895Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (481) Google Scholar). Briefly, CHO and H9c2 cells incubated for 24–48 h with various treatments were harvested by trypsinization and stained with 1 μM propidium iodide. The percentage of propidium iodide-positive cells was determined by flow cytometry (104 cells/sample). Previous studies have identified the ER as a target of palmitate-induced lipotoxicity downstream of the generation of ROS (14Borradaile N.M. Buhman K.K. Listenberger L.L. Magee C.J. Morimoto E.T. Ory D.S. Schaffer J.E. A critical role for eukaryotic elongation factor 1A-1 in lipotoxic cell death.Mol. Biol. Cell. 2006; 17: 770-778Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). To test the hypothesis that palmitate may also impair ER function more directly through its rapid incorporation into the ER membrane, we determined the subcellular distribution of palmitate within 1 h of exposure to a lipotoxic dose. CHO cells were incubated with 500 μM palmitate containing a trace amount of [3H]palmitate. Subsequent subcellular fractionation revealed that the bulk of the label was distributed between the crude mitochondrial fraction (58.00 ± 0.03%) and the rough microsomal fraction (22.90 ± 0.03%) (Fig. 1A ). Although a significant proportion of [3H]palmitate was associated with the relatively pure rough microsomal fraction, composed predominantly of rough ER, the crude mitochondria were contaminated with rough microsomes (Fig. 1C), indicating that the calculated percentage distribution actually underestimates the incorporation of palmitate into the rough ER. Similar distributions were observed upon labeling of CHO cells with oleate and upon labeling of CHO cells overexpressing SCD1 with palmitate. These SCD1-overexpressing cells have an increased capacity to introduce double bonds into palmitate by virtue of increased SCD1 activity (27Listenberger L.L. Han X. Lewis S.E. Cases S. Farese Jr., R.V. Ory D.S. Schaffer J.E. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 3077-3082Crossref PubMed Scopus (1381) Google Scholar). Thus, exogenous saturated and unsaturated FAs are channeled quickly to the ER as well as to the mitochondria. This distribution is independent of lipotoxicity, which occurs in CHO cells treated with palmitate but not in CHO cells treated with oleate or SCD1-overexpressing cells treated with palmitate (27Listenberger L.L. Han X. Lewis S.E. Cases S. Farese Jr., R.V. Ory D.S. Schaffer J.E. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 3077-3082Crossref PubMed Scopus (1381) Google Scholar). To determine whether modulating β-oxidation could alter the distribution observed with 500 μM palmitate, the same experiment was conducted in the presence of either etomoxir (an inhibitor of carnitine palmitoyl transferase 1) or AICAr [an activator of AMP-activated protein kinase (AMPK)] (Fig. 1A). These compounds were used at doses established previously to effectively inhibit or increase β-oxidation (35El-Assaad W. Buteau J. Peyot M.L. Nolan C. Roduit R. Hardy S. Joly E. Dbaibo G. Rosenberg L. Prentki M. Saturated fatty acids synergize with elevated glucose to cause pancreatic beta-cell death.Endocrinology. 2003; 144: 4154-4163Crossref PubMed Scopus (472) Google Scholar, 36Mishra R. Simonson M.S. Saturated free fatty acids and apoptosis in microvascular mesangial cells: palmitate activates pro-apoptotic signaling involving caspase 9 and mitochondrial release of endonuclease G.Cardiovasc. Diabetol. 2005; 4: 2Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). Etomoxir did not alter the subcellular distribution of [3H]palmitate within 1 h, whereas AICAr reduced the incorporation of palmitate into rough microsomes by ∼50%. Palmitate incorporation into mitochondria was also reduced in the presence of AICAr by ∼30%. The latter likely reflects a combination of decreased palmitate incorporation into rough microsomal membranes (which contaminate the crude mitochondrial fraction) and increased mitochondrial oxidation of palmitate. The distribution of palmitate observed with a nontoxic concentration of palmitate (5 μM) was nearly identical to that observed with 500 μM (Fig. 1B), suggesting that the initial trafficking of this fatty acid to various subcellular locations is not concentration-dependent. In contrast, the relative distribution of 2-bromopalmitate, used as a nonlipotoxic control, was markedly different, with the bulk of the label remaining in the cytosol (Fig. 1B). This modified fatty acid is not as good a substrate for acyl-CoA synthetases (37Oakes N.D. Kjellstedt A. Forsberg G.B. Clementz T. Camejo G. Furler S.M. Kraegen E.W. Olwegard-Halvarsson M. Jenkins A.B. Ljung B. Development and initial evaluation of a novel method for assessing tissue-specific plasma free fatty acid utilization in vivo using (R)-2-bromopalmitate tracer.J. Lipid Res. 1999; 40: 1155-1169Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar), resulting in limited uptake and toxicity compared with palmitate (4.4 ± 0.8% and 5.2 ± 0.4% cell death at 24 h for control and 500 μM 2-bromopalmitate, respectively). To assess the consequences of palmitate incorporation into rough microsomes on the composition of these membranes, we analyzed both newly synthesized and total lipids in this fraction after a 1 h incubation with 500 μM [2H]palmitate. The largest percentage of exogenous palmitate was incorporated into phosphatidylcholine (PC) species. However, significant proportions also remained as FFA or were incorporated into TAG species (Table 1, column 4). Overall, rough microsomes were composed primarily of PC and FFA, with very limited TAG content, corresponding to 50, 27, and 5% of the examined lipid mass content, respectively (Table 1, column 2). Thus, the labeled proportions of the rough microsomal pools of PC and FFA were relatively small, whereas the labeled proportion of the rough microsomal pool of TAG was significantly larger (Table 1, column 5). Unsaturated FAs make up the vast majority (81%) of acyl chain substituents in CHO cells under basal conditions (Table 2 ). Strikingly, the proportions of saturated PC and TAG in these membranes were increased by 1.5-fold (from 1.56% to 2.40%) and 3.0-fold (from 6.39% to 19.59%), respectively, with no significant change in total content of lipid species (Table 2). Thus, the remodeling of PC and TAG species accounted for a significant 1.3-fold increase (from 18.55% to 24.91%) in the saturated lipid content of rough microsomes from CHO cells incubated for 1 h with 500 μM palmitate.TABLE 1Distribution of deuterated palmitate in rough microsomes from CHO cellsLipid SpeciesTotal LipidDeuterated LipidDistribution of LabelDeuterated Lipid/Total Lipidnmol/mg protein%PC58.01 ± 6.494.15 ± 0.6542.09 ± 5.477.12 ± 0.48PA2.02 ± 0.210.00 ± 0.000.00 ± 0.000.00 ± 0.00PG2.83 ± 0.330.00 ± 0.000.00 ± 0.000.00 ± 0.00PI6.97 ± 0.240.22 ± 0.032.26 ± 0.273.19 ± 0.38LPC1.39 ± 0.250.21 ± 0.022.13 ± 0.0915.71 ± 1.61SM7.09 ± 1.370.12 ± 0.061.16 ± 0.581.46 ± 0.50Cer0.34 ± 0.060.06 ± 0.010.65 ± 0.0819.06 ± 1.04FFA31.06 ± 0.242.93 ± 0.5230.42 ± 6.629.42 ± 1.61TAG5.60 ± 1.052.12 ± 0.6021.29 ± 5.6736.37 ± 4.13Total115.29 ± 8.299.82 ± 0.421008.59 ± 0.61CHO cells were incubated for 1 h with 500 μM [7,7,8,8-2H]palmitate complexed to BSA at a molar ratio of 2:1. Rough microsomes were isolated by sequential centrifugation. Lipids were extracted and quantitated by electrospray ionization mass spectrometry. PC, phosphatidylcholine; PA, phosphatidic acid; PG, phosphatidylglycerol; PI, phosphatidylinositol; LPC, lysophosphatidylcholine; SM, sphingomyelin; Cer, ceramide; TAG, triacylglycerol. Values are means ± SEM. Open table in a new tab TABLE 2Lipid composition of rough microsomes from CHO cellsControlPalmitate-TreatedLipid SpeciesTotal Lipid (TL)Saturated Lipid (SL)SL/TLTotal Lipid (TL)Saturated Lipid (SL)SL/TLnmol/mg protein%nmol/mg protein%PC80.69 ± 11.731.22 ± 0.101.56 ± 0.1558.01 ± 6.491.43 ± 0.312.40 ± 0.27aP < 0.05 for control versus palmitate-treated.PA2.27 ± 0.120.00 ± 0.000.00 ± 0.002.02 ± 0.210.00 ± 0.000.00 ± 0.00PG3.63 ± 0.260.29 ± 0.027.90 ± 0.192.83 ± 0.330.23 ± 0.058.06 ± 0.87PI10.79 ± 1.550.00 ± 0.000.00 ± 0.006.97 ± 0.240.00 ± 0.000.00 ± 0.00LPC2.48 ± 0.531.46 ± 0.3558.07 ± 1.901.39 ± 0.250.83 ± 0.1360.70 ± 2.41SM8.28 ± 1.285.84 ± 1.0969.63 ± 3.247.09 ± 1.374.98 ± 0.8870.72 ± 1.52Cer0.66 ± 0.120.49 ± 0.1073.56 ± 3.700.34 ± 0.060.24 ± 0.0568.68 ± 2.86FFA29.29 ± 1.0216.91 ± 0.9457.65 ± 1.5131.06 ± 0.2419.

Insulin resistance is associated with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and is a major factor in the pathogenesis of type 2 diabetes. The development of hepatic insulin resistance has been ascribed to multiple causes, including inflammation, endoplasmic reticulum (ER) stress, and accumulation of hepatocellular lipids in animal models of NAFLD. However, it is unknown whether these same cellular mechanisms link insulin resistance to hepatic steatosis in humans. To examine the cellular mechanisms that link hepatic steatosis to insulin resistance, we comprehensively assessed each of these pathways by using flash-frozen liver biopsies obtained from 37 obese, nondiabetic individuals and correlating key hepatic and plasma markers of inflammation, ER stress, and lipids with the homeostatic model assessment of insulin resistance index. We found that hepatic diacylglycerol (DAG) content in cytoplasmic lipid droplets was the best predictor of insulin resistance ( R = 0.80, P < 0.001), and it was responsible for 64% of the variability in insulin sensitivity. Hepatic DAG content was also strongly correlated with activation of hepatic PKCε ( R = 0.67, P < 0.001), which impairs insulin signaling. In contrast, there was no significant association between insulin resistance and other putative lipid metabolites or plasma or hepatic markers of inflammation. ER stress markers were only partly correlated with insulin resistance. In conclusion, these data show that hepatic DAG content in lipid droplets is the best predictor of insulin resistance in humans, and they support the hypothesis that NAFLD-associated hepatic insulin resistance is caused by an increase in hepatic DAG content, which results in activation of PKCε.

To explore the hypothesis that alterations in ethanolamine plasmalogen may be directly related to the severity of dementia in Alzheimer's disease (AD), we performed a systematic examination of plasmalogen content in cellular membranes of gray and white matter from different regions of human subjects with a spectrum of AD clinical dementia ratings (CDR) using electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). The results demonstrate: (1) a dramatic decrease in plasmalogen content (up to 40 mol% of total plasmalogen) in white matter at a very early stage of AD (i.e. CDR 0.5); (2) a correlation of the deficiency in gray matter plasmalogen content with the AD CDR (i.e. approximately 10 mol% of deficiency at CDR 0.5 (very mild dementia) to approximately 30 mol% of deficiency at CDR 3 (severe dementia); (3) an absence of alterations of plasmalogen content and molecular species in cerebellar gray matter at any CDR despite dramatic alterations of plasmalogen content in cerebellar white matter. Alterations of ethanolamine plasmalogen content in two mouse models of AD, APP(V717F) and APPsw, were also examined by ESI/MS. A plasmalogen deficiency was present (up to 10 mol% of total plasmalogen at the age of 18 months) in cerebral cortices, but was absent in cerebella from both animal models. These results suggest plasmalogen deficiency may play an important role in the AD pathogenesis, particularly in the white matter, and suggest that altered plasmalogen content may contribute to neurodegeneration, synapse loss and synaptic dysfunction in AD.

To explore the role of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα)-mediated derangements in myocardial metabolism in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy, insulinopenic mice with PPARα deficiency (PPARα −/− ) or cardiac-restricted overexpression [myosin heavy chain (MHC)-PPAR] were characterized. Whereas PPARα −/− mice were protected from the development of diabetes-induced cardiac hypertrophy, the combination of diabetes and the MHC-PPAR genotype resulted in a more severe cardiomyopathic phenotype than either did alone. Cardiomyopathy in diabetic MHC-PPAR mice was accompanied by myocardial long-chain triglyceride accumulation. The cardiomyopathic phenotype was exacerbated in MHC-PPAR mice fed a diet enriched in triglyceride containing long-chain fatty acid, an effect that was reversed by discontinuing the high-fat diet and absent in mice given a medium-chain triglyceride-enriched diet. Reactive oxygen intermediates were identified as candidate mediators of cardiomyopathic effects in MHC-PPAR mice. These results link dysregulation of the PPARα gene regulatory pathway to cardiac dysfunction in the diabetic and provide a rationale for serum lipid-lowering strategies in the treatment of diabetic cardiomyopathy.

Lipid rafts are specialized cholesterol-enriched membrane domains that participate in cellular signaling processes. Caveolae are related domains that become invaginated due to the presence of the structural protein, caveolin-1. In this paper, we use electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS) to quantitatively compare the phospholipids present in plasma membranes and nondetergent lipid rafts from caveolin-1-expressing and nonexpressing cells. Lipid rafts are enriched in cholesterol and sphingomyelin as compared to the plasma membrane fraction. Expression of caveolin-1 increases the amount of cholesterol recovered in the lipid raft fraction but does not affect the relative proportions of the various phospholipid classes. Surprisingly, ESI/MS demonstrated that lipid rafts are enriched in plasmenylethanolamines, particularly those containing arachidonic acid. While the total content of anionic phospholipids was similar in plasma membranes and nondetergent lipid rafts, the latter were highly enriched in phosphatidylserine but relatively depleted in phosphatidylinositol. Detergent-resistant membranes made from the same cells showed a higher cholesterol content than nondetergent lipid rafts but were depleted in anionic phospholipids. In addition, these detergent-resistant membranes were not enriched in arachidonic acid-containing ethanolamine plasmalogens. These data provide insight into the structure of lipid rafts and identify potential new roles for these domains in signal transduction.

Abstract Introduction Increasing evidence suggests a role for the gut microbiome in central nervous system disorders and a specific role for the gut‐brain axis in neurodegeneration. Bile acids (BAs), products of cholesterol metabolism and clearance, are produced in the liver and are further metabolized by gut bacteria. They have major regulatory and signaling functions and seem dysregulated in Alzheimer's disease (AD). Methods Serum levels of 15 primary and secondary BAs and their conjugated forms were measured in 1464 subjects including 370 cognitively normal older adults, 284 with early mild cognitive impairment, 505 with late mild cognitive impairment, and 305 AD cases enrolled in the AD Neuroimaging Initiative. We assessed associations of BA profiles including selected ratios with diagnosis, cognition, and AD‐related genetic variants, adjusting for confounders and multiple testing. Results In AD compared to cognitively normal older adults, we observed significantly lower serum concentrations of a primary BA (cholic acid [CA]) and increased levels of the bacterially produced, secondary BA, deoxycholic acid, and its glycine and taurine conjugated forms. An increased ratio of deoxycholic acid:CA, which reflects 7α‐dehydroxylation of CA by gut bacteria, strongly associated with cognitive decline, a finding replicated in serum and brain samples in the Rush Religious Orders and Memory and Aging Project. Several genetic variants in immune response–related genes implicated in AD showed associations with BA profiles. Discussion We report for the first time an association between altered BA profile, genetic variants implicated in AD, and cognitive changes in disease using a large multicenter study. These findings warrant further investigation of gut dysbiosis and possible role of gut‐liver‐brain axis in the pathogenesis of AD.