KS
Kevin Smith
Author with expertise in Standards and Guidelines for Genetic Variant Interpretation
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
16
(50% Open Access)
Cited by:
2,023
h-index:
42
/
i10-index:
68
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

The Menin Tumor Suppressor Protein Is an Essential Oncogenic Cofactor for MLL-Associated Leukemogenesis

Akihiko Yokoyama et al.Oct 1, 2005
The Mixed-Lineage Leukemia (MLL) protein is a histone methyltransferase that is mutated in clinically and biologically distinctive subsets of acute leukemia. MLL normally associates with a cohort of highly conserved cofactors to form a macromolecular complex that includes menin, a product of the MEN1 tumor suppressor gene, which is mutated in heritable and sporadic endocrine tumors. We demonstrate here that oncogenic MLL fusion proteins retain an ability to stably associate with menin through a high-affinity, amino-terminal, conserved binding motif and that this interaction is required for the initiation of MLL-mediated leukemogenesis. Furthermore, menin is essential for maintenance of MLL-associated but not other oncogene induced myeloid transformation. Acute genetic ablation of menin reverses aberrant Hox gene expression mediated by MLL-menin promoter-associated complexes, and specifically abrogates the differentiation arrest and oncogenic properties of MLL-transformed leukemic blasts. These results demonstrate that a human oncoprotein is critically dependent on direct physical interaction with a tumor suppressor protein for its oncogenic activity, validate a potential target for molecular therapy, and suggest central roles for menin in altered epigenetic functions underlying the pathogenesis of hematopoietic cancers.
0
Citation557
0
Save
0

A Novel Monoclonal Antibody Against DOG1 is a Sensitive and Specific Marker for Gastrointestinal Stromal Tumors

Íñigo Espinosa et al.Feb 1, 2008
Gastrointestinal stromal tumors (GIST) occur primarily in the wall of the intestine and are characterized by activating mutations in the receptor tyrosine kinases genes KIT or PDGFRA. The diagnosis of GIST relies heavily on the demonstration of KIT/CD117 protein expression by immunohistochemistry. However, KIT expression is absent in ∼4% to 15% of GIST and this can complicate the diagnosis of GIST in patients who may benefit from treatment with receptor tyrosine kinase inhibitors. We previously identified DOG1/TMEM16A as a novel marker for GIST using a conventional rabbit antipeptide antiserum and an in situ hybridization probe. Here, we describe 2 new monoclonal antibodies against DOG1 (DOG1.1 and DOG1.3) and compare their staining profiles with KIT and CD34 antibodies on 447 cases of GIST. These included 306 cases with known mutational status for KIT and PDGFRA from a molecular consultation service. In addition, 935 other mesenchymal tumors and 432 nonsarcomatous tumors were studied. Both DOG1 antibodies showed high sensitivity and specificity for GIST, with DOG1.1 showing some advantages. This antibody yielded positive staining in 370 of 425 (87%) scorable GIST, whereas CD117 was positive in 317 of 428 (74%) GIST and CD34 in 254 of 430 (59%) GIST. In GIST with mutations in PDGFRA, 79% (23/29) showed DOG1.1 immunoreactivity while only 9% (3/32) and 27% (9/33) stained for CD117 and CD34, respectively. Only 1 of 326 (0.3%) leiomyosarcomas and 1 of 39 (2.5%) synovial sarcomas among the 935 soft tissue tumors examined showed positive immunostaining for DOG1.1. In addition, DOG1.1 immunoreactivity was seen in fewer cases of carcinoma, melanoma, and seminoma as compared with KIT.
0
Citation421
0
Save
0

Identification of rare-disease genes using blood transcriptome sequencing and large control cohorts

Laure Frésard et al.Jun 1, 2019
It is estimated that 350 million individuals worldwide suffer from rare diseases, which are predominantly caused by mutation in a single gene1. The current molecular diagnostic rate is estimated at 50%, with whole-exome sequencing (WES) among the most successful approaches2–5. For patients in whom WES is uninformative, RNA sequencing (RNA-seq) has shown diagnostic utility in specific tissues and diseases6–8. This includes muscle biopsies from patients with undiagnosed rare muscle disorders6,9, and cultured fibroblasts from patients with mitochondrial disorders7. However, for many individuals, biopsies are not performed for clinical care, and tissues are difficult to access. We sought to assess the utility of RNA-seq from blood as a diagnostic tool for rare diseases of different pathophysiologies. We generated whole-blood RNA-seq from 94 individuals with undiagnosed rare diseases spanning 16 diverse disease categories. We developed a robust approach to compare data from these individuals with large sets of RNA-seq data for controls (n = 1,594 unrelated controls and n = 49 family members) and demonstrated the impacts of expression, splicing, gene and variant filtering strategies on disease gene identification. Across our cohort, we observed that RNA-seq yields a 7.5% diagnostic rate, and an additional 16.7% with improved candidate gene resolution. A diagnostic tool based on blood RNA-seq is shown to identify causal genes and variants linked to clinical phenotypes in individuals with rare diseases for which whole-exome genetic sequencing was uninformative.
0
Citation260
0
Save
0

Viral apoptosis is induced by IRF-3-mediated activation of Bax

Saurabh Chattopadhyay et al.Apr 1, 2010
Article1 April 2010free access Viral apoptosis is induced by IRF-3-mediated activation of Bax Saurabh Chattopadhyay Saurabh Chattopadhyay Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Joao T Marques Joao T Marques Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Michifumi Yamashita Michifumi Yamashita Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Kristi L Peters Kristi L Peters Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Kevin Smith Kevin Smith Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Avanti Desai Avanti Desai Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Bryan R G Williams Bryan R G Williams Monash Institute of Medical Research, Monash University, Clayton, Victoria, Australia Search for more papers by this author Ganes C Sen Corresponding Author Ganes C Sen Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Saurabh Chattopadhyay Saurabh Chattopadhyay Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Joao T Marques Joao T Marques Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Michifumi Yamashita Michifumi Yamashita Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Kristi L Peters Kristi L Peters Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Kevin Smith Kevin Smith Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Avanti Desai Avanti Desai Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Bryan R G Williams Bryan R G Williams Monash Institute of Medical Research, Monash University, Clayton, Victoria, Australia Search for more papers by this author Ganes C Sen Corresponding Author Ganes C Sen Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA Search for more papers by this author Author Information Saurabh Chattopadhyay1, Joao T Marques1, Michifumi Yamashita1, Kristi L Peters1, Kevin Smith1, Avanti Desai1, Bryan R G Williams2 and Ganes C Sen 1 1Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA 2Monash Institute of Medical Research, Monash University, Clayton, Victoria, Australia *Corresponding author. Department of Molecular Genetics, Lerner Research Institute, 9500 Euclid Avenue, NE20, Cleveland, OH 44195, USA. Tel.: +1 216 444 0636; Fax: +1 216 444 0513; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2010)29:1762-1773https://doi.org/10.1038/emboj.2010.50 There is a Have you seen ...? (May 2010) associated with this Article. PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Upon infection with many RNA viruses, the cytoplasmic retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) pathway activates the latent transcription factor IRF-3, causing its nuclear translocation and the induction of many antiviral genes, including those encoding interferons. Here, we report a novel and distinct activity of IRF-3, in virus-infected cells, that induces apoptosis. Using genetically defective mouse and human cell lines, we demonstrated that, although both pathways required the presence of RIG-I, IPS1, TRAF3 and TBK1, only the apoptotic pathway required the presence of TRAF2 and TRAF6 in addition. More importantly, transcriptionally inactive IRF-3 mutants, such as the one missing its DNA-binding domain, could efficiently mediate apoptosis. Apoptosis was triggered by the direct interaction of IRF-3, through a newly identified BH3 domain, with the pro-apoptotic protein Bax, their co-translocation to the mitochondria and the resulting activation of the mitochondrial apoptotic pathway. Thus, IRF-3 is a dual-action cytoplasmic protein that, upon activation, translocates to the nucleus or to the mitochondrion and triggers two complementary antiviral responses of the infected cell. Introduction Viruses are obligatory intracellular pathogens that are a threat to all eukaryotes. Mammals have developed a plethora of anti-viral mechanisms, including the triggering of innate immune response that limits viral replication and spread (Kawai and Akira, 2006). There are several innate antiviral pathways activated by double-stranded RNA (dsRNA) (Peters et al, 2002), a common byproduct of virus replication. Extracellular dsRNA, produced by dead infected cells, is endocytosed and recognized by Toll-like receptor (TLR) 3 (Alexopoulou et al, 2001), which is primarily located on the endosomal membrane. TLR3 uses the adaptor protein TRIF (Yamamoto et al, 2003) to engage the protein kinase IKK to activate the transcription factor NF-κB and the protein kinases TBK1/IKKε (Fitzgerald et al, 2003) to activate the transcription factor IRF-3 (Doyle et al, 2002). In contrast, intracellular dsRNA, produced by replicating viruses that multiply in the cytoplasm, is recognized by cytoplasmic sensors, such as retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) and melanoma differentiation-associated gene 5 (Mda-5) (Yoneyama et al, 2004; Kato et al, 2006), which are RNA helicases, collectively called RIG-I-like helicases (RLH). They use the mitochondrial membrane-bound protein, IPS-1 (Kawai et al, 2005; Meylan et al, 2005; Seth et al, 2005; Xu et al, 2005) (also known as VISA, Cardif or MAVS), as the adaptor and recruits several members of the TRAF family proteins, which, in turn, activate the same protein kinases and transcription factors as TLR3. These transcription factors drive transcription of the interferon genes and many interferon-stimulated genes (ISG), which are essential for both innate and adaptive antiviral defenses (Kawai and Akira, 2006). Another common cellular antiviral response is apoptosis (Barber, 2001); premature cell death limits virus replication and spreading. We have reported that IRF-3, the transcription factor that induces transcription of the antiviral genes, also has a central role in mediating apoptosis of paramyxovirus-infected cells, as manifested by the fact that infected cells are not killed in its absence (Peters et al, 2008). Moreover, if IRF-3 is activated by virus infection, neither interferon signalling nor NF-κB activation is needed to trigger apoptosis. In the absence of IRF-3 activation, the cells become persistently infected and continuously produce infectious virions (Peters et al, 2008). Our observations made an interesting connection between innate immune response and the apoptotic response of a virus-infected cell through the common requirement of IRF-3 for both processes. Here, we report that the pro-apoptotic action of IRF-3 is distinct and independent of its transcriptional activity. Activation of RLH signalling led to activation of both transcriptional and apoptotic activities of IRF-3 by two distinct signalling pathways, which required shared proteins as well as pathway-specific proteins. Our investigation revealed the presence of a BH3 domain in IRF-3, which enabled activated IRF-3 to interact with the pro-apoptotic protein Bax; this was followed by their translocation to the mitochondria and activation of the intrinsic apoptotic pathway. Results IRF-3 activation by cytoplasmic dsRNA signalling causes apoptosis We used wild type and genetically altered human and mouse cell lines to investigate the mechanism of apoptosis caused by infection with Sendai virus (SeV), a paramyxovirus, or by transfected dsRNA, both of which activate the cytoplasmic helicases (Kato et al, 2006). Apoptosis was monitored by several complementary criteria, such as cell killing, Trypan Blue exclusion, induction of caspase 3/7 activity (Marques et al, 2005), TUNEL assay, DNA fragmentation and cleavage of PARP (Peters et al, 2008). Apoptosis caused by SeV required the presence of IRF-3 (Figure 1A); human HT1080 cells were completely killed upon SeV infection, but not when IRF-3 expression was ablated by siRNA (panels 1 and 2). As expected, P2.1, an IRF-3-deficient mutant cell line (Peters et al, 2002), was refractory to apoptosis, but when IRF-3 expression was restored in these cells they became susceptible to viral killing (panels 3 and 4). Similar results were obtained when cells were transfected with dsRNA, which activates RLH; in contrast, activation of the TLR3 pathway by dsRNA added to the culture medium (Sarkar et al, 2004) did not cause apoptosis (Figure 1B), although signalling by both TLR3 and RLH caused gene induction (Supplementary Figure S1A) and IRF-3 phosphorylation (Supplementary Figure S1B; Sarkar et al, 2004). The RLH pathway, but not the TLR3 pathway, triggered caspase activation in primary mouse dendritic cells (Figure 1C) and peritoneal macrophages (Supplementary Figure S1C), although both pathways induced genes in cells of both lineages (data not shown). Similar to IRF-3-deficient human cells, IRF-3−/− mouse fibroblasts were resistant to dsRNA-mediated apoptosis, although they were as susceptible as Wt cells to apoptosis caused by TNF (Figure 1D). IRF-3 and RLH signalling-dependent apoptotic cell death was further demonstrated by additional complementary assays such as Trypan Blue exclusion (Supplementary Figure S1D), PARP cleavage (Figure 1E), DNA fragmentation (Figure 1F) and TUNEL assay (Supplementary Figure S1E). The individual cell-based assays, such as TUNEL assay or vital dye exclusion assay, often showed that not all cells, but only a fraction, were undergoing apoptosis. This was, almost exclusively, due to inefficient transfection of the activator, dsRNA, especially into mouse primary cells. For dissecting the mechanism underlying IRF-3-mediated apoptosis, we decided to use MEF as our primary test cells because many genetically defective MEFs are easily available. Figure 1.IRF-3 activation by cytoplasmic dsRNA signalling triggers apoptosis. (A) HT1080-derived cell lines were infected with Sendai virus and 3 days after infection culture fields were photographed. 1, U4C cells (Wt); 2, IRF-3-knocked-down HT1080 cells (Wt-siIRF-3); 3, P2.1 cells (IRF-3− mutant); 4, IRF-3-restored P2.1 cells. (B) HT1080 cells were treated (TLR3) or transfected (RIG-I) with poly(I:C) for 16 h when caspase activation was measured. (C) Primary bone-marrow-derived dendritic cells (DCs), isolated from Wt C57Bl/6 mice, were treated (TLR3) or transfected (RIG-I) with poly(I:C); caspase activity was measured 16 h after treatment. (D) Wt and IRF-3 KO MEFs were transfected with 8 μg/ml of poly(I:C) or treated with 100 ng/ml of TNF and 1 μg/ml of cycloheximide (CHX) for 16 h, when caspase activation was measured; fold induction of caspase activity of Wt MEFs was considered as 100 and all other values were normalized to this. (E) Wt, IRF-3− mutant and IRF-3-restored cells (as described in (A)) were transfected with poly(I:C) and PARP cleavage was analysed 16 h after transfection by western blot. (F) Wt and Wt-siIRF-3 cells (as described in (A)) were transfected with poly(I:C) for the indicated time, when cellular DNA was isolated and analysed by running on 1.5% agarose gel. The left panel shows kinetics of DNA fragmentation for Wt cells. For the above experiments, 2 μg/ml of poly(I:C) was transfected (B, C, E, F) or 100 μg/ml of poly(I:C) was added into the culture medium in (B, C); fold induction of caspase activity by RIG-I signalling in response to transfected poly(I:C) was considered as 100 and other values were normalized to this (B, C). Download figure Download PowerPoint Shared need of dsRNA-signalling proteins for both gene induction and apoptotic actions of IRF-3 To investigate the obvious possibility that IRF-3-mediated transcriptional induction of pro-apoptotic genes causes the observed apoptosis, we compared the signalling proteins that are required for the two effects. Several proteins that mediate transcriptional signalling by virus or dsRNA-activated pathways have been identified. In the next series of experiments, we investigated whether these proteins are also required for the apoptotic pathway. For this purpose, we used knock-out MEFs or other methods of selective functional disruption of the test genes. A human cell line expressing a dominant-negative mutant of RIG-I (Yoneyama et al, 2004; Kato et al, 2006) was completely resistant to apoptosis caused by SeV infection (Figure 2A), confirming that, for SeV, RIG-I was the relevant receptor. RIG-I and Mda-5 are the two major cytoplasmic RNA helicases that recognize viral or transfected RNA to trigger transcriptional signalling. Between these two, Mda-5 was not required for apoptosis, but caspase 3/7 activation and TUNEL positivity were greatly reduced in RIG-I−/− MEF (Figure 2B and C). The residual activation observed in the RIG-I−/− MEF could be mediated by Mda-5, which can substitute for RIG-I in its absence. It is important to note that the dsRNA stimulator used in these experiments was a mixture of long and short RNAs; for gene induction, the former is recognized by Mda-5, whereas the latter is recognized by RIG-I (Kato et al, 2008). The mitochondrial adaptor protein, IPS-1, was also required for apoptosis: mouse IPS-1−/− cells were resistant to dsRNA-induced apoptosis (Figure 2B and C). Expression of the HCV protease, NS3.4A, that cleaved IPS-1 (Meylan et al, 2005) blocked apoptosis by transfected dsRNA (Figure 2D) or SeV infection (Supplementary Figure S2A), and gene induction (Figure 2E) by SeV infection of human cells. Requirement of TRAF3, an essential component of RIG-I signalling, was also tested by using TRAF3−/− MEF cells. The results indicate that this protein was also essential for both dsRNA-induced apoptosis (Figure 2B) and gene induction (Supplementary Figure S2B). For mediating transcriptional signalling, IPS-1 recruits the protein kinase, TBK1, which phosphorylates and activates IRF-3. We, therefore, tested the requirement of TBK1 in causing apoptosis by using TBK1−/− MEF and human cells expressing a dominant-negative mutant of TBK1. In both cell types, dsRNA-mediated caspase activation and cell killing were severely inhibited (Figure 2B and D and Supplementary Figure S2C). As expected, the induction of the IRF-3-dependent ISG56 gene was blocked in the HT1080 cells expressing TBK1-DN (Figure 2F). These results showed that RIG-I, IPS-1, TRAF3 and TBK1 were all needed for mediating both gene induction and the apoptotic effects of IRF-3. Figure 2.Components of RIG-I signalling are required for apoptosis. (A) HT1080 cells (Wt) and HT1080 cells expressing a dominant-negative mutant of RIG-I (RIG-Ic) were infected with SeV; 3 days after infection culture fields were photographed. (B) Wt and KO MEF cells (as indicated) were transfected with poly(I:C), caspase activity was measured after 16 h; fold induction of caspase activity of Wt MEFs was considered as 100 and all other values were normalized to this. (C) Wt and knockout MEF cells (as indicated), grown on coverslips, were transfected with poly(I:C) for 16 h, when the cells were stained with FITC-conjugated TUNEL; TUNEL-positive and DAPI-stained cells were counted under the microscope and percent TUNEL-positive cells are presented. (D) Human cells expressing Hepatitis C virus protease NS3.4A or HT1080 cells expressing a dominant-negative mutant of TBK1 (TBK1-DN) were used for this experiment. The cells were transfected with poly(I:C), caspase activity was measured 16 h after transfection. (E) Cell lysates from NS3.4A-expressing cells (as described in (C)) were analysed for induction of P56 by SeV infection (6 h after infection) by western blot. (F) TBK1-DN (DN)-expressing cells (as described in (C)) were analysed for induction of P56 by western blot, 6 h after poly(I:C) transfection. Download figure Download PowerPoint Identification of pathway-specific signalling proteins In addition to the signalling proteins discussed above, several other adaptor proteins, including TRAF2 and TRAF6, have been implicated in the dsRNA-signalling pathways. As mentioned above, TRAF3 was required for both transcriptional and apoptotic pathways (Figure 2B and Supplementary Figure S2B); we tested the roles of the other TRAF proteins for these pathways. It has been shown that TRAF2 and TRAF6 are recruited by mitochondrial adaptor protein IPS-1 upon RIG-I activation (Xu et al, 2005). We investigated their requirement by testing genetically deficient MEF cells and observed that both TRAF2 and TRAF6 proteins were essential for the IRF-3-mediated apoptotic pathway; caspase activation (Figure 3A) and TUNEL staining (Figure 3B) in response to dsRNA signalling were significantly inhibited in the deficient cells. However, neither of these two adaptor proteins was needed for IRF-3-mediated gene induction (Figure 3C and D). Taken together, the above analyses of the needs for specific signalling proteins strongly suggest that dsRNA-elicited activation of IRF-3 for gene induction and apoptosis uses partially overlapping but distinct pathways. Figure 3.Additional components are required for apoptotic pathway. (A) Wt, TRAF2 KO and TRAF6 KO MEFs were transfected with poly(I:C); caspase activity was measured 16 h after transfection. (B) Wt and KO MEF cells (as indicated) were transfected with poly(I:C); 16 h after transfection the cells were stained with FITC-conjugated TUNEL; TUNEL-positive and DAPI-stained cells were counted under the microscope and the percentage of positive cells are shown here. (C, D) Wt and KO MEF cells (as indicated) were transfected with poly(I:C); induction of P54 was analysed 12 h after transfection, by western blot. Download figure Download PowerPoint dsRNA-mediated apoptosis is independent of IRF-3-driven gene induction The above observation of the pathway-specific requirement of signalling components raised the intriguing possibility that the apoptotic pathway, although IRF-3 dependent, does not require gene induction. Indeed, when new gene expression was blocked by the transcriptional inhibitor, actinomycin D, or the translational inhibitor, cycloheximide (CHX), dsRNA-induced PARP cleavage remained unabated, although, as expected, gene induction was completely blocked (Figure 4A). The unexpected observation that apoptosis needed IRF-3, but not new gene expression, raised the possibility that IRF-3 might have a separate function that is distinct and separable from its role as a transcription factor. As shown in Figure 4B, the amino-terminal region of IRF-3 contains the DNA-binding domain (DBD), the nuclear localization signal (NLS) and the nuclear export signal, whereas the carboxyl-terminal domain contains the critical serine residues (S385, S386, S396 and S398), of which signal-dependent phosphorylation and the resultant IRF-3 dimerization and nuclear translocation are required for activating IRF-3 as a transcription factor (Yoneyama et al, 2004). To determine whether the same changes in the properties of IRF-3 are required for mediating apoptosis, we used mutants of IRF-3 that are deficient in driving transcription. For this purpose, we used IRF-3-deficient human cells, in which IRF-3 expression had been ablated by siRNAs that are targeted to the untranslated regions of IRF-3 mRNA. As expected, restoring Wt IRF-3 expression (by transfecting a cDNA that encoded only the translated region of human IRF-3 mRNA) in IRF-3-ablated HT1080 cells restored apoptosis and gene induction in response to dsRNA (Figure 4C and Supplementary Figures S3A and S3B) or SeV (Supplementary Figure S3C). We used this system to examine whether apoptosis was dependent on and mediated by IRF-3-induced genes and tested the apoptotic properties of IRF-3 mutants that are incapable of supporting gene transcription. One such mutant of IRF-3, 396AA, is incapable of inducing gene transcription (Supplementary Figure S3A) because it lacks two critical serine residues, 396 and 398, that are targets of signal-induced phosphorylation (Lin et al, 1998). However, this mutant was perfectly functional in the apoptosis assay (Figure 4C and Supplementary Figure S3C). Two other mutants, missing Ser385 or Ser386, were similarly effective in inducing apoptosis (Figure 4C), but not gene expression (Supplementary Figure S3B). A more drastic mutant of IRF-3, IRF-3ΔDBD (Figure 4B), which has a deletion of the entire DBD and the NLS, could also mediate apoptosis as assayed by PARP cleavage (Figure 4D) and caspase activation (Supplementary Figure S3D); it obviously could not induce gene transcription because of the defects in nuclear translocation and promoter-binding ability (Figure 4E). These results clearly showed that the transcriptional and the apoptotic functions of IRF-3 are distinct, and that the apoptotic effect is not mediated by the products of IRF-3-inducible genes. Figure 4.dsRNA-signalling-mediated apoptosis is independent of IRF-3-driven gene induction. (A) HT1080 cells were transfected with poly(I:C) in the presence or absence of the protein synthesis inhibitor, cycloheximide, or the RNA synthesis inhibitor, actinomycin D, for 12 h, when the cell extracts were analysed for cleaved PARP and P56 induction by western blot. (B) A schematic representation of IRF-3; DNA-binding domain (DBD), nuclear localization signal (NLS), nuclear export signal (NES) and critical phosphoacceptor sites on the C-terminus are indicated. (C) HT1080-siIRF-3 cells expressing Wt IRF-3 (Wt), IRF-3 396/98AA mutant (396AA), IRF-3 385/86AA mutant (385AA) or IRF-3 386A (a stable pool of cells) were transfected with poly(I:C); caspase activity was measured after 16 h and the cell lysates were analysed for the expression of IRF-3 mutant proteins. (D, E) HT1080-siIRF-3 cells expressing Wt or DBD-deleted IRF-3 mutant (ΔDBD, IRF-3 residues 1–112 were deleted, as in (A)) were transfected with poly(I:C) and the cell extracts were analysed for cleaved PARP (16 h after transfection) or P56 induction (6 h after transfection) by western blot. Download figure Download PowerPoint dsRNA-induced apoptosis is accompanied by mitochondrial translocation of IRF-3 The two major branches of apoptosis, the intrinsic and the extrinsic pathways, are triggered, respectively, by the activation of caspase 9 and caspase 8 (Galluzzi et al, 2008); however, the two pathways interact, and often primary activation of one causes secondary activation of the other as well. To understand the nature of the apoptosis caused by RLH signalling, we investigated the involved pathway. Both apoptotic pathways were activated by RLH signalling, as indicated by the cleavage of both caspase 9 and caspase 8 (Figure 5A). However, an inhibitor of caspase 9, but not of caspase 8, blocked apoptosis (Figure 5B), suggesting that the IRF-3-mediated apoptosis might be mediated by the intrinsic mitochondrial pathway. Moreover, ablation of caspase 9 by the corresponding siRNA blocked the dsRNA-induced apoptosis; however, an siRNA-mediated ablation of caspase 8 did not affect the PARP cleavage induced by dsRNA (Figure 5C and D). As expected from activation of the mitochondrial apoptotic pathway, cytochrome c (Cyt c) was released from the mitochondria to the cytoplasm when RLH signalling was triggered (Figure 5E). To delineate the mechanism of IRF-3-mediated activation of the mitochondrial apoptotic pathway, we inquired whether IRF-3 itself was translocated to the mitochondria. Indeed, signal-dependent translocation of IRF-3 to the mitochondria could be demonstrated by subcellular fractionation followed by western blotting; much more IRF-3 was present in the mitochondrial and the nuclear fractions after dsRNA treatment of cells (Figure 5F). These results demonstrated that IRF-3-mediated apoptosis is accompanied by mitochondrial translocation of IRF-3 and concomitant activation of the mitochondrial apoptotic pathway. Figure 5.dsRNA-induced apoptosis is accompanied by mitochondrial translocation of IRF-3. (A) HT1080 cells were transfected with poly(I:C) for the indicated time, when the cell extracts were analysed for the activation of caspase 8 and caspase 9 by western blot. (B) HT1080 cells were transfected with poly(I:C) in the presence or absence of caspase inhibitors (caspase 8 inhibitor, z-IETD-FMK, and caspase 9 inhibitor, z-LEHD-FMK, as indicated); cell extracts were analysed for cleaved PARP by western blot. (C, D) HT1080 cells were transfected with siRNAs specific for caspase 8, caspase 9 or a control siRNA against cyclophilin A (Dharmacon); 48 h after transfection, the cells were transfected with poly(I:C) and analysed for PARP cleavage or, as indicated, by western blot. (E) Wt IRF-3-expressing cells were transfected with poly(I:C) for the indicated time, when the cytosolic fractions were analysed for Cyt c release by western blot. (F) Wt IRF-3-expressing cells (doubly tagged with N-terminal V5 and C-terminal Flag) were transfected with poly(I:C) for the indicated time, when the mitochondrial and nuclear fractions were isolated and analysed for the presence of IRF-3 and other proteins, as indicated, by western blot. Download figure Download PowerPoint Bax interacts with IRF-3 and is translocated to the mitochondria To further analyse the mechanism of IRF-3-mediated activation of the mitochondrial apoptotic pathway, we wondered whether IRF-3 interacts with any pro-apoptotic protein of the Bcl-2 family that is known to trigger this process. Surprisingly, there was a strong interaction between IRF-3 and the pro-apoptotic protein Bax, in SeV-infected cells, as revealed by the co-immunoprecipitation of the two proteins (Figure 6A). A similar interaction was observed in dsRNA-transfected cells (Supplementary Figure S4A). For these co-immunoprecipitation experiments, cells were extracted in a buffer containing the detergent Triton X-100, which sometimes promotes artifactual interactions between proteins. To eliminate this possibility we repeated the co-immunoprecipitation experiment in a buffer containing a different detergent, CHAPS, which does not create similar problems, and confirmed IRF-3/Bax interaction (Supplementary Figure S4B). The observed interaction was Bax-specific; several other members of the Bcl-2 family, including Bak, did not interact with IRF-3 (Figure 6B). To establish that the IRF-3/Bax interaction was direct, and not mediated by an intermediate protein, we purified activated IRF-3 from dsRNA-stimulated cells and used it for binding to recombinant GST-Bax. IRF-3 was pulled down by GST-Bax, but not by GST (Figure 6C). To identify the structural element in IRF-3 that mediates its interaction with Bax, several deletion mutants of IRF-3 were tested (see Figure 4B). Deletion of even a short region (residues 366–427) from the carboxyl terminal of IRF-3 eliminated the interaction (Figure 6D). In contrast, as expected (see Figure 4D), the amino-terminal region was dispensable for interaction; a mutant missing residues 1–112, encompassing the DBD still interacted with Bax. Examination of the sequence of the essential region of IRF-3 revealed the presence of a putative BH3 domain with a strong homology to the corresponding domains of a number of pro-apoptotic proteins. Molecular modelling confirmed that this domain could assume the helical structure of a BH3 domain with charged residues on one side and hydrophobic residues on the other (Figure 6E). When we introduced point mutations in IRF-3, which were expected to functionally disrupt the BH3 domain, IRF-3/Bax interaction was eliminated (Figure 6F). These results clearly showed that IRF-3 contains a BH3 domain, near its carboxyl terminus, which enables it to interact with Bax. Figure 6.IRF-3 interacts with Bax using a BH3-like domain on its C-terminus. (A) HT1080-siIRF-3 cells expressing Wt IRF-3 were infected with SeV; 2 h after infection IRF-3 was immunoprecipitated and analysed for Bax by western blot. (B) HT1080-siIRF-3 cells expressing Wt IRF-3 (or empty vector, EV) were transfected with poly(I:C) for 2 h and the cell lysates were immunoprecipitated with IRF-3 antibody and the immunoprecipitates were analysed for the indicated proteins by western blot. (C) IRF-3 was purified from human cells as described in Materials and methods and used for in vitro interaction assay with recombinant GST-conjugated human Bax (ABNOVA) and the reaction mixture was pulled down with GST beads and analysed for IRF-3 by western blot. (D) HT1080-siIRF-3 cells were transiently co-transfected with N-terminally V5-tagged Wt or deletion mutants of IRF-3 (as indicated) and N-terminally His-tagged Bax; 16 h after transfection cells were transfected with dsRNA for 2 h, when the cell lysates were treated with Ni-NTA and bound proteins were analysed for IRF-3 by western blot. (E) Human IRF-3 residues
0
Citation245
0
Save
0

The origin, evolution, and functional impact of short insertion–deletion variants identified in 179 human genomes

Stephen Montgomery et al.Mar 11, 2013
Short insertions and deletions (indels) are the second most abundant form of human genetic variation, but our understanding of their origins and functional effects lags behind that of other types of variants. Using population-scale sequencing, we have identified a high-quality set of 1.6 million indels from 179 individuals representing three diverse human populations. We show that rates of indel mutagenesis are highly heterogeneous, with 43%–48% of indels occurring in 4.03% of the genome, whereas in the remaining 96% their prevalence is 16 times lower than SNPs. Polymerase slippage can explain upwards of three-fourths of all indels, with the remainder being mostly simple deletions in complex sequence. However, insertions do occur and are significantly associated with pseudo-palindromic sequence features compatible with the fork stalling and template switching (FoSTeS) mechanism more commonly associated with large structural variations. We introduce a quantitative model of polymerase slippage, which enables us to identify indel-hypermutagenic protein-coding genes, some of which are associated with recurrent mutations leading to disease. Accounting for mutational rate heterogeneity due to sequence context, we find that indels across functional sequence are generally subject to stronger purifying selection than SNPs. We find that indel length modulates selection strength, and that indels affecting multiple functionally constrained nucleotides undergo stronger purifying selection. We further find that indels are enriched in associations with gene expression and find evidence for a contribution of nonsense-mediated decay. Finally, we show that indels can be integrated in existing genome-wide association studies (GWAS); although we do not find direct evidence that potentially causal protein-coding indels are enriched with associations to known disease-associated SNPs, our findings suggest that the causal variant underlying some of these associations may be indels.
0
Citation238
0
Save
1

Temporal dynamics of the multi-omic response to endurance exercise training across tissues

David Amar et al.Sep 23, 2022
Abstract Regular exercise promotes whole-body health and prevents disease, yet the underlying molecular mechanisms throughout a whole organism are incompletely understood. Here, the Molecular Transducers of Physical Activity Consortium (MoTrPAC) profiled the temporal transcriptome, proteome, metabolome, lipidome, phosphoproteome, acetylproteome, ubiquitylproteome, epigenome, and immunome in whole blood, plasma, and 18 solid tissues in Rattus norvegicus over 8 weeks of endurance exercise training. The resulting data compendium encompasses 9466 assays across 19 tissues, 25 molecular platforms, and 4 training time points in young adult male and female rats. We identified thousands of shared and tissue- and sex-specific molecular alterations. Temporal multi-omic and multi-tissue analyses demonstrated distinct patterns of tissue remodeling, with widespread regulation of immune, metabolism, heat shock stress response, and mitochondrial pathways. These patterns provide biological insights into the adaptive responses to endurance training over time. For example, exercise training induced heart remodeling via altered activity of the Mef2 family of transcription factors and tyrosine kinases. Translational analyses revealed changes that are consistent with human endurance training data and negatively correlated with disease, including increased phospholipids and decreased triacylglycerols in the liver. Sex differences in training adaptation were widespread, including those in the brain, adrenal gland, lung, and adipose tissue. Integrative analyses generated novel hypotheses of disease relevance, including candidate mechanisms that link training adaptation to non-alcoholic fatty liver disease, inflammatory bowel disease, cardiovascular health, and tissue injury and recovery. The data and analysis results presented in this study will serve as valuable resources for the broader community and are provided in an easily accessible public repository ( https://motrpac-data.org/ ). Highlights Multi-tissue resource identifies 35,439 analytes regulated by endurance exercise training at 5% FDR across 211 combinations of tissues and molecular platforms. Interpretation of systemic and tissue-specific molecular adaptations produced hypotheses to help describe the health benefits induced by exercise. Robust sex-specific responses to endurance exercise training are observed across multiple organs at the molecular level. Deep multi-omic profiling of six tissues defines regulatory signals for tissue adaptation to endurance exercise training. All data are available in a public repository, and processed data, analysis results, and code to reproduce major analyses are additionally available in convenient R packages.
1
Citation14
0
Save
1

Multiple Causal Variants Underlie Genetic Associations in Humans

Nathan Abell et al.May 25, 2021
ABSTRACT The majority of associations between genetic variation and human traits and diseases are non-coding and in strong linkage disequilibrium (LD) with surrounding genetic variation. In these cases, a single causal variant is often assumed to underlie the association, however no systematic assessment of the number of causal variants has been performed. In this study, we applied a massively parallel reporter assay (MPRA) in lymphoblastoid cells to functionally evaluate 49,256 allelic pairs, representing 30,893 genetic variants in high, local linkage disequilibrium for 744 independent cis-expression quantitative trait loci (eQTL) and assessed each for colocalization across 114 traits. We identified 8,502 allele-independent regulatory regions containing 1,264 allele-specific regulatory variants, and found that 17.7% of eQTL contained more than one significant allelic effect. We show that detected regulatory variants are highly and specifically enriched for activating chromatin structures and allelic transcription factor binding, for which ETS-domain family members are a large driver. Integration of MPRA profiles with eQTL/complex trait colocalizations identified causal variant sets for associations with blood cell measurements, Asthma, Multiple Sclerosis, Inflammatory Bowel Disease, and Crohn’s Disease. These results demonstrate that a sizable number of association signals are manifest through multiple, tightly-linked causal variants requiring high-throughput functional assays for fine-mapping.
1
Citation5
0
Save
0

Impact of genome build on RNA-seq interpretation and diagnostics

Rachel Ungar et al.Jun 3, 2024
Transcriptomics is a powerful tool for unraveling the molecular effects of genetic variants and disease diagnosis. Prior studies have demonstrated that choice of genome build impacts variant interpretation and diagnostic yield for genomic analyses. To identify the extent genome build also impacts transcriptomics analyses, we studied the effect of the hg19, hg38, and CHM13 genome builds on expression quantification and outlier detection in 386 rare disease and familial control samples from both the Undiagnosed Diseases Network and Genomics Research to Elucidate the Genetics of Rare Disease Consortium. Across six routinely collected biospecimens, 61% of quantified genes were not influenced by genome build. However, we identified 1,492 genes with build-dependent quantification, 3,377 genes with build-exclusive expression, and 9,077 genes with annotation-specific expression across six routinely collected biospecimens, including 566 clinically relevant and 512 known OMIM genes. Further, we demonstrate that between builds for a given gene, a larger difference in quantification is well correlated with a larger change in expression outlier calling. Combined, we provide a database of genes impacted by build choice and recommend that transcriptomics-guided analyses and diagnoses are cross referenced with these data for robustness.
0
Citation1
0
Save
0

Impact of the X chromosome and sex on regulatory variation

Kimberly Kukurba et al.Aug 7, 2015
The X chromosome, with its unique mode of inheritance, contributes to differences between the sexes at a molecular level, including sex-specific gene expression and sex-specific impact of genetic variation. We have conducted an analysis of the impact of both sex and the X chromosome on patterns of gene expression identified through transcriptome sequencing of whole blood from 922 individuals. We identified that genes on the X chromosome are more likely to have sex-specific expression compared to the autosomal genes. Furthermore, we identified a depletion of regulatory variants on the X chromosome, especially among genes under high selective constraint. In contrast, we discovered an enrichment of sex-specific regulatory variants on the X chromosome. To resolve the molecular mechanisms underlying such effects, we generated and connected sex-specific chromatin accessibility to sex-specific expression and regulatory variation. As sex-specific regulatory variants can inform sex differences in genetic disease prevalence, we have integrated our data with genome-wide association study data for multiple immune traits and to identify traits with significant sex biases. Together, our study provides genome-wide insight into how the X chromosome and sex shape human gene regulation and disease.
Load More