Lec13 cells, a variant Chinese hamster ovary cell line, were used to produce human IgG1 that were deficient in fucose attached to the Asn297-linked carbohydrate but were otherwise similar to that found in IgG1 produced in normal Chinese hamster ovary cell lines and from human serum. Lack of fucose on the IgG1 had no effect on binding to human FcγRI, C1q, or the neonatal Fc receptor. Although no change in affinity was found for the His131 polymorphic form of human FcγRIIA, a slight improvement in binding was evident for FcγRIIB and the Arg131 FcγRIIA polymorphic form. In contrast, binding of the fucose-deficient IgG1 to human FcγRIIIA was improved up to 50-fold. Antibody-dependent cellular cytotoxicity assays using purified peripheral blood monocytes or natural killer cells from several donors showed enhanced cytotoxicity, especially evident at lower antibody concentrations. When combined with an IgG1 Fc protein variant that exhibited enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity, the lack of fucose was synergistic. Lec13 cells, a variant Chinese hamster ovary cell line, were used to produce human IgG1 that were deficient in fucose attached to the Asn297-linked carbohydrate but were otherwise similar to that found in IgG1 produced in normal Chinese hamster ovary cell lines and from human serum. Lack of fucose on the IgG1 had no effect on binding to human FcγRI, C1q, or the neonatal Fc receptor. Although no change in affinity was found for the His131 polymorphic form of human FcγRIIA, a slight improvement in binding was evident for FcγRIIB and the Arg131 FcγRIIA polymorphic form. In contrast, binding of the fucose-deficient IgG1 to human FcγRIIIA was improved up to 50-fold. Antibody-dependent cellular cytotoxicity assays using purified peripheral blood monocytes or natural killer cells from several donors showed enhanced cytotoxicity, especially evident at lower antibody concentrations. When combined with an IgG1 Fc protein variant that exhibited enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity, the lack of fucose was synergistic. neonatal Fc receptor antibody-dependent cellular cytotoxicity Chinese hamster ovary dihydrofolate reductase enzyme-linked immunosorbent assay monoclonal antibody natural killer cell peripheral blood monocytic cell The nature and importance of the conserved, Asn297-linked carbohydrate in influencing immunoglobulin G effector functions has long been recognized (1Nose M. Wigzell H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1983; 80: 6632-6636Crossref PubMed Scopus (394) Google Scholar, 2Rudd M.P. Ellliot T. Cresswell P. Wilson I.A. Dwek R.A. Science. 2001; 291: 2370-2376Crossref PubMed Scopus (1426) Google Scholar, 3Jefferis R. Lund J. Pound J.D. Immunol. Rev. 1998; 163: 59-76Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar, 4Wright A. Morrison S.L. Trends Biotechnol. 1997; 15: 26-32Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (275) Google Scholar). Variations in composition of the carbohydrate have been shown to affect the affinity of IgG for the three classes of FcγR (3Jefferis R. Lund J. Pound J.D. Immunol. Rev. 1998; 163: 59-76Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar, 4Wright A. Morrison S.L. Trends Biotechnol. 1997; 15: 26-32Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (275) Google Scholar) (FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), and FcγRIII (CD16)) that link IgG antibody-mediated immune responses with cellular effector functions (5Ravetch J.V. Bolland S. Annu. Rev. Immunol. 2001; 19: 275-290Crossref PubMed Scopus (1407) Google Scholar, 6Gessner J.E. Heiken H. Tamm A. Schmidt R.E. Ann. Hematol. 1998; 76: 231-248Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar, 7Gavin A. Hulett M. Hogarth P.M. van de Winkel J.G.J. Hogarth P.M. The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity. Kluwer Academic Publishers BV, Dordrecht, The Netherlands1998: 11-35Crossref Google Scholar). Carbohydrate composition also influences the activity of IgG in the classical pathway of complement activation, which is initiated by IgG1 binding to C1q (3Jefferis R. Lund J. Pound J.D. Immunol. Rev. 1998; 163: 59-76Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar, 4Wright A. Morrison S.L. Trends Biotechnol. 1997; 15: 26-32Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (275) Google Scholar, 8Makrides S.C. Pharmacol. Rev. 1998; 50: 59-87PubMed Google Scholar) and to mannose-binding protein, which structurally resembles C1q (9Weis W.I. Taylor M.E. Drickamer K. Immunol. Rev. 1998; 163: 19-34Crossref PubMed Scopus (914) Google Scholar, 10Malhotra R. Wormald M.R. Rudd P.M. Fischer P.B. Dwek R.A. Sim R.B. Nat. Med. 1995; 1: 237-243Crossref PubMed Scopus (696) Google Scholar, 11Wright A. Morrison S.L. J. Immunol. 1998; 160: 3393-3402PubMed Google Scholar). The role of carbohydrate in the clearance rate of IgG remains unclear. Binding of aglycosyl IgG to the neonatal Fc receptor (FcRn)1 appears unperturbed (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar, 13Hobbs S.M. Jackson L.E. Hoadley J. Mol. Immunol. 1992; 29: 949-956Crossref PubMed Scopus (27) Google Scholar, 14Kim J.-K. Tsen M.-F. Ghetie V. Ward E.S. Eur. J. Immunol. 1994; 24: 542-548Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar); however, in some studies, glycosylated and aglycosyl-matched mAb show no appreciable difference in clearance rate in mice (13Hobbs S.M. Jackson L.E. Hoadley J. Mol. Immunol. 1992; 29: 949-956Crossref PubMed Scopus (27) Google Scholar, 15Tao M.H. Morrison S.L. J. Immunol. 1989; 143: 2595-2601PubMed Google Scholar, 16Horan Hand P.H. Calvo B. Milenic D. Yokota T. Finch M. Snoy P. Garmestani K. Gansow O. Schlom J. Kashmiri S.V.S. Cancer Immunol. Immunother. 1992; 35: 165-174Crossref PubMed Scopus (32) Google Scholar), whereas in other studies differences have been detected (15Tao M.H. Morrison S.L. J. Immunol. 1989; 143: 2595-2601PubMed Google Scholar, 16Horan Hand P.H. Calvo B. Milenic D. Yokota T. Finch M. Snoy P. Garmestani K. Gansow O. Schlom J. Kashmiri S.V.S. Cancer Immunol. Immunother. 1992; 35: 165-174Crossref PubMed Scopus (32) Google Scholar, 17Wawrzynczak E.J. Cumber A.J. Parnell G.D. Jones P.T. Winter G. Mol. Immunol. 1992; 29: 213-220Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). Clearance of mAb may also be affected by variation in galactosylation through binding of agalactosyl IgG to mannose-binding protein or mannose receptors (10Malhotra R. Wormald M.R. Rudd P.M. Fischer P.B. Dwek R.A. Sim R.B. Nat. Med. 1995; 1: 237-243Crossref PubMed Scopus (696) Google Scholar, 11Wright A. Morrison S.L. J. Immunol. 1998; 160: 3393-3402PubMed Google Scholar). For IgG from either serum or produced ex vivo in hybridomas or engineered cells, the IgG are heterogeneous with respect to the Asn297-linked carbohydrate (3Jefferis R. Lund J. Pound J.D. Immunol. Rev. 1998; 163: 59-76Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar, 4Wright A. Morrison S.L. Trends Biotechnol. 1997; 15: 26-32Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (275) Google Scholar, 18Jefferis R. Lund J. Mizutani H. Nakagawa H. Kawazoe Y. Arata Y. Takahashi N. Biochem. J. 1990; 268: 529-537Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 19Raju S. Briggs J.B. Borge S.M. Jones A.J.S. Glycobiology. 2000; 10: 477-486Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar). For human IgG the core oligosaccharide normally consists of Asn297-Nδ2- GlcNAc(fucose)-GlcNAc-mannose-(mannose-GlcNAc)2(Fig. 1). Variation among individual IgG includes attachment of galactose and/or galactose-sialic acid at one or both of the terminal GlcNAc and/or attachment of a third GlcNAc arm (bisecting GlcNAc). The presence or absence of terminal galatose or sialic acid residues affects IgG function (11Wright A. Morrison S.L. J. Immunol. 1998; 160: 3393-3402PubMed Google Scholar, 20Jassal R. Jenkins N. Charlwood J. Camilleri P. Jefferis R. Lund J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 286: 243-249Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar, 21Groenink J. Spijker J. van den Herik-Oudijk I.E. Boeije L. Rook G. Aarden L. van de Winkel J.G.J. van den Broek M.F. Eur. J. Immunol. 1996; 26: 1404-1407Crossref PubMed Scopus (24) Google Scholar, 22Boyd P.N. Lines A.C. Patel A.K. Mol. Immunol. 1995; 32: 1311-1318Crossref PubMed Scopus (240) Google Scholar, 23Kumpel B.M. Rademacher T.W. Rook G.A.W. Williams P.J. Wilson I.R.H. Hum. Antibod. Hybridomas. 1994; 5: 143-151PubMed Google Scholar, 24Tsuchiya N . Endo T. Matsuta K. Yoshinoya S. Aikawa T. Kosuge E. Takeuchi F. Miyamoto T. Kobata A. J. Rheumatol. 1989; 16: 285-290PubMed Google Scholar), and attachment of a third arm to the carbohydrate via bisecting GlcNAc has been reported to improve antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) (25Umaña P. Jean-Mairet J. Moudry R. Amstutz H. Bailey J.E. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 176-180Crossref PubMed Scopus (667) Google Scholar, 26Davies J. Jiang L. Pan L.-Y. LaBarre M.J. Anderson D. Reff M. Biotechnol. Bioeng. 2001; 74: 288-294Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar). A connection between IgG glycosylation and some human diseases has been shown (e.g. the level of galactosylation appears correlated with rheumatoid arthritis) (27Parekh R.B. Dwek R.A. Sutton B.J. Fernandes D.L. Leung A. Stanworth D. Rademacher T.W. Mizuochi T. Taniguchi T. Matsuda K. Takeuchi F. Nagano Y. Miyamoto T. Kobata A. Nature. 1985; 316: 452-457Crossref PubMed Scopus (1033) Google Scholar). Several recombinant monoclonal antibodies (mAbs) are being used as human therapeutics (28Glennie M.J. Johnson P.W.M. Immunol. Today. 2000; 21: 403-410Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (282) Google Scholar). Some of these (e.g. mAbs that bind to a receptor or soluble ligand and thereby block ligand-receptor interaction) may function without utilizing antibody effector mechanisms. Abrogating immune system recruitment for these mAbs can be achieved by altering IgG residues in the lower hinge region (29Armour K.L. Clark M.R. Hadley A.G. Williamson L.M. Eur. J. Immunol. 1999; 29: 2613-2624Crossref PubMed Scopus (159) Google Scholar, 30Duncan A.R. Woof J.M. Partridge L.J. Burton D.R. Winter G. Nature. 1988; 332: 563-564Crossref PubMed Scopus (279) Google Scholar), using IgG2 or IgG4 subclasses, which are relatively less efficient in effector function, or using F(ab) or F(ab′)2 fragments (although these may have undesirable clearance rates). Other mAbs may need to recruit the immune system to kill the target cell (31Sampson J.H. Crotty L.E. Lee S. Archer G.E. Ashley D.M. Wikstrand C.J. Hale L.P. Small C. Dranoff G. Friedman A.H. Friedman H.S. Bigner D.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 7503-7508Crossref PubMed Scopus (172) Google Scholar, 32Clynes R.A. Towers T.L. Presta L.G. Ravetch J.V. Nat. Med. 2000; 6: 443-446Crossref PubMed Scopus (2381) Google Scholar, 33Clynes R. Takechi Y. Moroi Y. Houghton A. Ravetch J.V. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 652-656Crossref PubMed Scopus (270) Google Scholar, 34Anderson D.R. Grillo-Lopez A. Varns C. Chambers K.S. Hanna N. Biochem. Soc. Trans. 1997; 25: 705-708Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar). In those circumstances where recruitment of immune effector cells is desirable for therapeutic mAb efficacy, engineering the IgG Fc portion to improve effector function (via improved binding to IgG receptors and/or complement) could be a valuable enhancement to antibody therapeutics. Currently, methods that improve the immune system recruitment include bispecific antibodies in which one arm of the antibody binds to an IgG receptor (35Segal D.M. Weiner G.J. Weiner L.M. J. Immunol. Methods. 2001; 248: 1-6Crossref PubMed Scopus (32) Google Scholar), IgG-cytokine fusion proteins (36Penichet M.L. Morrison S.L. J. Immunol. Methods. 2001; 248: 91-101Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar), alteration of the IgG Fc sequence for improved binding to FcγR (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar), and optimization of the Asn297-linked carbohydrate (25Umaña P. Jean-Mairet J. Moudry R. Amstutz H. Bailey J.E. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 176-180Crossref PubMed Scopus (667) Google Scholar, 26Davies J. Jiang L. Pan L.-Y. LaBarre M.J. Anderson D. Reff M. Biotechnol. Bioeng. 2001; 74: 288-294Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar, 37Lifely M.R. Hale C. Royce S. Keen M.J. Phillips J. Glycobiology. 1995; 5: 813-822Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar). To evaluate the role of fucosylated oligosaccharide in IgG function, the Lec13 cell line (38Ripka J. Adamany A. Stanley P. Arch. Biochem. Biophys. 1986; 249: 533-545Crossref PubMed Scopus (71) Google Scholar) was utilized to express human IgG1. This Chinese hamster ovary (CHO) cell line is deficient in its ability to add fucose but provided IgG with oligosaccharide that was otherwise similar to that found in normal CHO cell lines and from human serum (18Jefferis R. Lund J. Mizutani H. Nakagawa H. Kawazoe Y. Arata Y. Takahashi N. Biochem. J. 1990; 268: 529-537Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 19Raju S. Briggs J.B. Borge S.M. Jones A.J.S. Glycobiology. 2000; 10: 477-486Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar, 39Routier F.H. Davies M.J. Bergemann K. Hounsell E.F. Glycoconj. J. 1997; 14: 201-207Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). The resultant IgGs were used to evaluate the effect of fucosylated carbohydrate on antibody effector functions, including binding to human FcγR, human C1q, human FcRn, and ADCC using human effector cells. The heavy and light chains of Hu4D5 (40Carter P. Presta L. Gorman C.M. Ridgway J.B.B. Henner D. Wong W.L.T. Rowland A.M. Kotts C. Carver M.E. Shepard M.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 4285-4291Crossref PubMed Scopus (1648) Google Scholar) and HuE27 (41Presta L.G. Lahr S.J. Shields R.L. Porter J.P. Gorman C.M. Jardieu P.M. J. Immunol. 1993; 151: 2623-2632PubMed Google Scholar) were subcloned into a previously described mammalian cell expression vector (42Lucas B.. Giere L.M. DeMarco R.A. Shen A. Chisholm V. Crowley C.W. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 1774-1779Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar) with the modification of a puromycin site fused 5′ to the dihydrofolate reductase (DHFR) site to form a fusion gene. Puromycin is used as a selective marker in DHFR(+) cells such as the Lec13 cells and the DHFR site was retained for methotrexate amplification of the stable cell line. The CHO cell line Pro-Lec13.6a (Lec13), was obtained from Professor Pamela Stanley of Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University. Parental lines were Pro− (proline auxotroph) and GAT− (glycine, adenosine, thymidine auxotroph). The CHO-DP12 cell line used for wild-type antibodies is a derivative of the CHO-K1 cell line (ATCC number CCL-61) which is DHFR-deficient and has a reduced requirement for insulin. Cell lines were transfected with cDNA using the Superfect method (Qiagen, Valencia, CA). Selection of stably transfected Lec13 cells expressing mAbs was performed using puromycin dihydrochloride (Calbiochem) at 10 μg/ml in growth medium containing minimal essential medium-α medium with l-glutamine, ribonucleosides, and deoxyribonucleosides (Invitrogen), supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum (Invitrogen), 10 mm HEPES, and 1× penicillin/streptomycin (Invitrogen). Selection of wild-type CHO-DP12 cells was performed in growth medium containing Ham's F-12 without GHT (glycine, hypoxanthine, thymidine), low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium without glycine with NaHCO3, supplemented with 5% dialyzed fetal bovine serum (Invitrogen), 10 mm HEPES, 2 mml-glutamine, and penicillin/streptomycin. Colonies formed within 2–3 weeks and were pooled for expansion. The pools were seeded initially at 3 × 106 cells/10-cm plate for small batch protein expression. The cells were converted to serum-free medium once they grew to 90–95% confluence, and after 3–5 days cell supernatants were collected and quantified for mAb expression using both an anti-IgG-Fc and an anti-intact IgG ELISA. For each batch of mAb, Lec13 and wild-type CHO cells were seeded at ∼8 × 106 cells/15-cm plate 1 day prior to converting to PSO4 (43Mather, J. P., and Tsao, M. C. (June 16, 1992) U. S. Patent 5,122,469Google Scholar) production medium, supplemented with 10 mg/liter recombinant human insulin and 1 mg/liter trace elements (43Mather, J. P., and Tsao, M. C. (June 16, 1992) U. S. Patent 5,122,469Google Scholar). Cells remained in serum-free production medium for 3–5 days. Supernatants were collected and clarified by centrifugation in 150-ml conical tubes to remove cells and debris. The protease inhibitors phenylmethylsulfonyl fluoride and aprotinin (Sigma) were added, and the supernatants were concentrated 5-fold on stirred cells using MWCO30 filters (Amicon, Beverly, MA) prior to immediate purification using protein A chromatography (Amersham Biosciences). All proteins were buffer-exchanged into phosphate-buffered saline using Centriprep-30 concentrators (Amicon) and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Protein concentrations were determined using A280 and verified using amino acid composition analysis. On average, the Lec13 cells generated 10 μg of mAb per 15-cm plate; expression in control CHO cells for all antibodies was 4–5 times higher than in the Lec13 cells. Antibodies generated from CHO-DP12 grown on plates will be denoted as CHO-P. CHO-DP12 cells were also grown in spinner flasks. Cells were seeded at 6 × 105 cells/ml and grown at 37 °C for 2 days. On the third day, the temperature was shifted to 33 °C, and the cells were allowed to grow until viability dropped to 70% due to the pH dropping to ∼6.5. Antibodies derived from CHO-DP12 cells grown in spinner flasks will be denoted as CHO-S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectral analysis was used to characterize the Asn297-linked oligosaccharides on the mAbs following a previously described protocol (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar, 44Papac D.I. Briggs J.B. Chin E.T. Jones A.J.S. Glycobiology. 1998; 8: 445-454Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar). Assays for measuring binding of monomeric IgG1 to FcγRI and FcRn (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar), binding of trimeric IgG1 to FcγRII and FcγRIII (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar), and binding of dimeric IgG1 to FcγR (45Huizinga T.W.J. Kerst M. Nuyens J.H. Vlug A. von dem Borne A.E.G.K. Roos D. Tetteroo P.A.T. J. Immunol. 1989; 142: 2359-2364PubMed Google Scholar) and ADCC assays with natural killer (NK) cells and peripheral blood monocytes (PBMC) of FcγRIIIA genotyped donors have been described previously (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar). The assay used to measure binding to human C1q has also been previously described (46Idusogie E.E. Presta L.G. Gazzano-Santoro H. Totpal K. Wong P.Y. Ultsch M. Meng Y.G. Mulkerrin M.G. J. Immunol. 2000; 164: 4178-4184Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar). Immunofluorescence staining of purified NK cells from an FcγRIIIA(Phe158/Phe158) donor was performed using Hu4D5 variants. NK cells were purified by negative selection and gated with phycoerythrin-conjugated anti-CD56 and fluorescein isothiocyanate-conjugated anti-CD16 (Pharmingen, San Diego, CA). Cells were adjusted to 2 × 106/ml and incubated with 2 μg/ml Hu4D5 variants for 30 min in ice-cold phosphate-buffered saline containing 0.1% bovine serum albumin, 0.01% sodium azide. Cells were then washed, and antibody binding was detected by incubating with fluorescein isothiocyanate-conjugated F(ab′)2 goat anti-human IgG for 30 min. Anti-HER2 Hu4D5 mAb (40Carter P. Presta L. Gorman C.M. Ridgway J.B.B. Henner D. Wong W.L.T. Rowland A.M. Kotts C. Carver M.E. Shepard M.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 4285-4291Crossref PubMed Scopus (1648) Google Scholar) expressed in stably transfected Lec13 cells consistently had about 10% fucosylated carbohydrate (TableI). In contrast, Hu4D5 mAbs from stably transfected CHO-DP12 cells cultured in spinner flasks (CHO-S) or plates (CHO-P) showed about 98% fucosylated carbohydrate. The variation in galactosylation for the Lec13 mAbs was similar to that found for CHO-S mAbs (as opposed to CHO-P) (Table I); hence, CHO-S mAbs were used as reference in the binding assays.Table ICarbohydrate analysis of antibodiesVariant1-aHu4D5, humanized anti-p185HER2 IgG1 (40); HuE27, humanized anti-IgE IgG1 (41); CHO-S, IgG expressed by CHO cells in spinner flasks; CHO-P, IgG expressed by CHO cells on 15-cm plates; Lec, IgG expressed by Lec13 cells on 15-cm plates; HEK, IgG expressed by human embryonic kidney 293 cells on 15-cm plates; AAA, S298A/E333A/K334A IgG1 variant (12). For Lec-X and Lec-AAA-X, X represents independently expressed lots of IgG.Without fucoseWith fucoseMan1-bValues are percentage of total oligosaccharide. Glycoforms were determined by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectral analysis following a previously described protocol (12, 44). Man, incompletely processed, hypermannosylated oligosaccharides containing 5–8 mannose units (19). Gal0, Gal1, Gal2 are oligosaccharides with no (agalactosyl), one (monogalactosyl), or two (digalactosyl) galactose residues covalently linked to the terminal GlcNAc residues (see Fig. 1). Mean ± S.D. is provided for six independently expressed lots of Hu4D5-Lec13 (A–E), three independently expressed lots of Hu4D5 Lec13-AAA (A–C), and three independently expressed lots of HuE27-HEK293. None of the mAbs contained measurable triantennary oligosaccharide (bisecting GlcNAc), and sialylated oligosaccharide was less than 6% of total oligosaccharide.Gal0Gal1Gal2TotalGal0Gal1Gal2TotalHu4D5 CHO-S120035042698 CHO-P020027025398 Lec-A048385912428 Lec-B0513549044210 Lec-C049395932417 Lec-D1463658847213 Lec-E3503138766113 Lec-F1513148756213 Lec-Avg1 ± 149 ± 235 ± 34 ± 189 ± 34 ± 25 ± 12 ± 111 ± 3 HEK-AAA162202047181580 Lec-AAA-A073212962114 Lec-AAA-B071183924408 Lec-AAA-C565183914329 Lec-AAA-Avg2 ± 370 ± 419 ± 23 ± 193 ± 33 ± 13 ± 21 ± 17 ± 3HuE27 HEK-A102211549251084 HEK-B18111215019978 HEK-C110201343301588 HEK-Avg13 ± 41 ± 11 ± 11 ± 116 ± 447 ± 425 ± 611 ± 383 ± 5 CHO-P020027026298 Lec1363657878621 HEK-AAA1711019511713811-a Hu4D5, humanized anti-p185HER2 IgG1 (40Carter P. Presta L. Gorman C.M. Ridgway J.B.B. Henner D. Wong W.L.T. Rowland A.M. Kotts C. Carver M.E. Shepard M.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 4285-4291Crossref PubMed Scopus (1648) Google Scholar); HuE27, humanized anti-IgE IgG1 (41Presta L.G. Lahr S.J. Shields R.L. Porter J.P. Gorman C.M. Jardieu P.M. J. Immunol. 1993; 151: 2623-2632PubMed Google Scholar); CHO-S, IgG expressed by CHO cells in spinner flasks; CHO-P, IgG expressed by CHO cells on 15-cm plates; Lec, IgG expressed by Lec13 cells on 15-cm plates; HEK, IgG expressed by human embryonic kidney 293 cells on 15-cm plates; AAA, S298A/E333A/K334A IgG1 variant (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar). For Lec-X and Lec-AAA-X, X represents independently expressed lots of IgG.1-b Values are percentage of total oligosaccharide. Glycoforms were determined by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectral analysis following a previously described protocol (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar, 44Papac D.I. Briggs J.B. Chin E.T. Jones A.J.S. Glycobiology. 1998; 8: 445-454Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar). Man, incompletely processed, hypermannosylated oligosaccharides containing 5–8 mannose units (19Raju S. Briggs J.B. Borge S.M. Jones A.J.S. Glycobiology. 2000; 10: 477-486Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar). Gal0, Gal1, Gal2 are oligosaccharides with no (agalactosyl), one (monogalactosyl), or two (digalactosyl) galactose residues covalently linked to the terminal GlcNAc residues (see Fig. 1). Mean ± S.D. is provided for six independently expressed lots of Hu4D5-Lec13 (A–E), three independently expressed lots of Hu4D5 Lec13-AAA (A–C), and three independently expressed lots of HuE27-HEK293. None of the mAbs contained measurable triantennary oligosaccharide (bisecting GlcNAc), and sialylated oligosaccharide was less than 6% of total oligosaccharide. Open table in a new tab Monomeric Hu4D5-Lec13 IgG1 bound to human FcγRI equivalent to binding of Hu4D5-CHO-S (Table II). The EC50 values (∼0.1 μg/ml) correspond to an affinity constant of 0.7 nm, at the lower end of the range of previously determined values (6Gessner J.E. Heiken H. Tamm A. Schmidt R.E. Ann. Hematol. 1998; 76: 231-248Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar, 7Gavin A. Hulett M. Hogarth P.M. van de Winkel J.G.J. Hogarth P.M. The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity. Kluwer Academic Publishers BV, Dordrecht, The Netherlands1998: 11-35Crossref Google Scholar). In contrast to FcγRI, IgG binding to the low affinity FcγR (FcγRII and FcγRIII) required the formation of dimers (Hu4D5 and HuE27) or trimers (HuE27) (12Shields R.L. Namenuk A.K. Hong K. Meng Y.G. Rae J. Briggs J. Xie D. Lai J. Stadlen A., Li, B. Fox J.A. Presta L.G. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-6604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (982) Google Scholar, 47Liu J. Lester P. Builder S. Shire S.J. Biochemistry. 1995; 34: 10474-10482Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar) to detect binding. For FcγRIIA there are naturally occurring allotypes at position 131 that result in different binding avidities for IgG2 (48Clark M.R. Clarkson S.B. Ory P.A. Stollman N. Goldstein I.M. J. Immunol. 1989; 143: 1731-1734PubMed Google Scholar, 49Warmerdam P.A.M. van de Winkel J.G.J. Vlug A. Westerdaal N.A.C. Capel P.J.A. J. Immunol. 1991; 147: 1338-1343PubMed Google Scholar). Binding of Hu4D5-Lec13 dimers to the FcγRIIA(Arg131) polymorphic form and to FcγRIIB exhibited only a slight improvement compared with Hu4D5-CHO-S (Fig.2, A and B). Lack of fucose did not affect binding to the FcγRIIA(His131) polymorphic form (Fig. 2C). Note that in contrast to FcγRI and FcγRIIIA, binding of the antibodies to FcγRIIA and FcγRIIB did not reach a plateau at the highest concentration used (10 μg/ml) (Fig. 2, A and B); hence, EC50 values could not be calculated. At concentrations above 10 μg/ml, aggregation of mAb was problematic.Table IIBinding of antibodies to human FcγRI and FcγRIIIAVariant2-aHu4D5, humanized anti-p185HER2 IgG1 (40); HuE27, humanized anti-IgE IgG1 (41); CHO-S, IgG expressed by CHO cells in spinner flasks; CHO-P, IgG expressed by CHO cells on 15-cm plates; Lec13, IgG expressed by Lec13 cells on 15-cm plates; HEK293, IgG expressed by human embryonic kidney 293 cells on 15-cm plates; AAA, S298A/E333A/K334A IgG1 variant (12).EC50nMeanS.D.μg/mlFcγRI/Hu4D5 monomers2-bTwo independent lots of Hu4D5-Lec13 (A and B) used with four assays for lot A and five assays for lot B. CHO-S0.090.045 CHO-P0.110.075 Lec13-Avg0.090.059FcγRIIIA (Phe158)/Hu4D5 dimers2-cFour independent lots of Hu4D5-Lec13 (A, B, C, and D) used with three assays per lot; three independent lots of Hu4D5-Lec13-AAA (A, B, and C) used with 1–3 assays per lot. CHO-S>106 CHO-P>103 Lec13-Avg0.240.0416 HEK293-AAA0.280.032 Lec13-AAA-Avg0.160.016FcγRIIIA (Phe158)/HuE27 dimers HEK293∼31 CHO-P>100.013 Lec130.190.043FcγRIIIA (Phe158)/HuE27 trimers HEK2930.200.033 CHO-P0.630.343 Lec130.050.023 HEK293-AAA0.070.013FcγRIIIA (Val158)/Hu4D5 dimers2-cFour independent lots of Hu4D5-Lec13 (A, B, C, and D) used with three assays per lot; three independent lots of Hu4D5-Lec13-AAA (A, B, and C) used with 1–3 assays per lot. CHO-S1.300.606 CHO-P1.660.182 Lec13-Avg0.070.0214 HEK293-AAA0.110.012 Lec13-AAA-Avg0.040.016FcγRIIIA (Val158)/HuE27 dimers HEK2930.501 CHO-P2.500.072 Lec130.050.013FcγRIIIA (Val158)/HuE27 trimers HEK2930.060.033 CHO-P0.060.023 Lec130.040.023 HEK293-AAA0.040.013VariantA490(Var)/A490(CHO-S)nMeanS.D.FcγRIIIA (Phe158)-transfected CHO cells/Hu4D5 monomers2-d[mAb] = 2.2 μg/ml. Three independent lots of Hu4D5-Lec13 (D, E, and F) used with three or four assays per lot; two independent lots of Hu4D5-Lec13-AAA (B and C) used with three assays per lot. CHO-S1.004 Lec13-Avg16.12.510 HEK293-AAA10.71.43 Lec13-AAA-Avg26.45.662-a Hu4D5, humanized anti-p185HER2 IgG1 (40Carter P. Presta L. Gorman C.M. Ridgway J.B.B. Henner D. Wong W.L.T. Rowland A.M. Kotts C. Carver M.E. Shepard M.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 4285-4291Crossref PubMed Scopus (1648) Google Scholar); HuE27, humanized anti-IgE IgG1 (41Presta L.G. Lahr S.J. Shields R.L. Porter J.P. Gorman C.M. Jardieu P.M. J. Immunol. 1993; 151: 2623-2632PubMed Google Scholar); CHO-S, IgG expressed by CHO cells in spinner flasks; CHO-P, IgG expressed by CHO cells on 15-cm plates; Lec13, IgG expressed by Lec13 cells on

Immunoglobulin G (IgG) Fc receptors play a critical role in linking IgG antibody-mediated immune responses with cellular effector functions. A high resolution map of the binding site on human IgG1 for human FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, and FcRn receptors has been determined. A common set of IgG1 residues is involved in binding to all FcγR; FcγRII and FcγRIII also utilize residues outside this common set. In addition to residues which, when altered, abrogated binding to one or more of the receptors, several residues were found that improved binding only to specific receptors or simultaneously improved binding to one type of receptor and reduced binding to another type. Select IgG1 variants with improved binding to FcγRIIIA exhibited up to 100%enhancement in antibody-dependent cell cytotoxicity using human effector cells; these variants included changes at residues not found at the binding interface in the IgG/FcγRIIIA co-crystal structure (Sondermann, P., Huber, R., Oosthuizen, V., and Jacob, U. (2000)Nature 406, 267–273). These engineered antibodies may have important implications for improving antibody therapeutic efficacy. Immunoglobulin G (IgG) Fc receptors play a critical role in linking IgG antibody-mediated immune responses with cellular effector functions. A high resolution map of the binding site on human IgG1 for human FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, and FcRn receptors has been determined. A common set of IgG1 residues is involved in binding to all FcγR; FcγRII and FcγRIII also utilize residues outside this common set. In addition to residues which, when altered, abrogated binding to one or more of the receptors, several residues were found that improved binding only to specific receptors or simultaneously improved binding to one type of receptor and reduced binding to another type. Select IgG1 variants with improved binding to FcγRIIIA exhibited up to 100%enhancement in antibody-dependent cell cytotoxicity using human effector cells; these variants included changes at residues not found at the binding interface in the IgG/FcγRIIIA co-crystal structure (Sondermann, P., Huber, R., Oosthuizen, V., and Jacob, U. (2000)Nature 406, 267–273). These engineered antibodies may have important implications for improving antibody therapeutic efficacy. monoclonal antibody antibody-dependent cell cytotoxicity antibody-independent cell cytotoxicity enzyme-linked immunosorbent assay IgG Fc γ-receptor neonatal IgG Fc receptor human glutathione S-transferase lactate dehydrogenase maximal response natural killer cells peripheral blood monocytes (R)-phycoerythrin spontaneous release vascular endothelial growth factor polymerase chain reaction matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry Chinese hamster ovary phosphate-buffered saline bovine serum albumin Monoclonal antibodies (mAbs)1 are increasingly being used as therapeutics in human disease (1King D.J. Adair J.R. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 1999; 2: 110-117PubMed Google Scholar, 2Vaswani S.K. Hamilton R.G. Ann. Allergy Asthma Immunol. 1998; 81: 105-119Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (49) Google Scholar, 3Holliger P. Hoogenboom H. Nat. Biotechnol. 1998; 16: 1015-1016Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar). Although some of these, e.g. mAbs that bind to a receptor or ligand and thereby block ligand-receptor interaction, may function without utilizing antibody effector mechanisms, other mAbs may need to recruit the immune system to kill the target cell (4Clynes R.A. Towers T.L. Presta L.G. Ravetch J.V. Nat. Med. 2000; 6: 443-446Crossref PubMed Scopus (2340) Google Scholar, 5Clynes R. Takechi Y. Moroi Y. Houghton A. Ravetch J.V. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 652-656Crossref PubMed Scopus (269) Google Scholar, 6Anderson D.R. Grillo-Lopez A. Varns C. Chambers K.S. Hanna N. Biochem. Soc. Trans. 1997; 25: 705-708Crossref PubMed Scopus (240) Google Scholar). If immune system recruitment is desirable for a therapeutic mAb, engineering the IgG Fc portion to improve effector function (via improved binding to IgG receptors and/or complement) could be a valuable enhancement to antibody therapeutics. Currently, immune system recruitment can be abrogated by altering IgG residues in the lower hinge region (7Armour K.L. Clark M.R. Hadley A.G. Williamson L.M. Eur. J. Immunol. 1999; 29: 2613-2624Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar, 8Duncan A.R. Woof J.M. Partridge L.J. Burton D.R. Winter G. Nature. 1988; 332: 563-564Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar), using human IgG2 or IgG4 subclasses that are comparatively inefficient in effector function or using antibody F(ab) or F(ab′)2fragments (although these may have undesirable rapid clearance rates). There are few methods that improve immune system recruitment; these include bispecific antibodies, in which one arm of the antibody binds to an IgG receptor (9Weiner L.M. Alpaugh R.K. von Mehren M. Cancer Immunol. Immunother. 1997; 45: 190-192Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar), cytokine-IgG fusion proteins (10Peng L.S. Penichet M.L. Morrison S.L. J. Immunol. 1999; 163: 250-258PubMed Google Scholar), and optimization of the Asn297-linked carbohydrate (11Uma-a P. Jean-Mairet J. Moudry R. Amstutz H. Bailey J.E. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 176-180Crossref PubMed Scopus (650) Google Scholar, 12Lifely M.R. Hale C. Royce S. Keen M.J. Phillips J. Glycobiology. 1995; 5: 813-822Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar). Alteration of clearance rate is also being investigated (13Ghetie V. Popov S. Borvak J. Radu C. Matesol D. Medesan C. Ober R.J. Ward E.S. Nat. Biotechnol. 1997; 15: 637-640Crossref PubMed Scopus (223) Google Scholar). IgG Fc receptors play a critical role in linking IgG antibody-mediated immune responses with cellular effector functions. The latter include release of inflammatory mediators, endocytosis of immune complexes, phagocytosis of microorganisms, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), and regulation of immune system cell activation (14Gessner J.E. Heiken H. Tamm A. Schmidt R.E. Ann. Hematol. 1998; 76: 231-248Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar, 15Gavin A. Hulett M. Hogarth P.M. van de Winkel J.G.J. Hogarth P.M. The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity. Kluwer Academic Publishers Group, Dordrecht, The Netherlands1998: 11-35Crossref Google Scholar, 16Sautes C. Fridman W.H. Sautes C. Cell-mediated Effects of Immunoglobulins. R. G. Landes Co., Austin, TX1997: 29-66Crossref Google Scholar, 17Da'ron M. Annu. Rev. Immunol. 1997; 15: 203-234Crossref PubMed Scopus (1050) Google Scholar). One group of IgG Fc receptors, FcγR, are expressed on leukocytes and are composed of three distinct classes as follows: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), and FcγRIII (CD16). In humans, the latter two classes can be further divided into FcγRIIA and FcγRIIB, FcγRIIIA and FcγRIIIB. Structurally, the FcγR are all members of the immunoglobulin superfamily, having an IgG-binding α-chain with an extracellular portion composed of either two (FcγRII and FcγRIII) or three (FcγRI) Ig-like domains. In addition, FcγRI and FcγRIII have accessory protein chains (γ and ζ) associated with the α-chain that function in signal transduction. The receptors are also distinguished by their affinity for IgG. FcγRI exhibits a high affinity for IgG, Ka = 108–109m−1 (14Gessner J.E. Heiken H. Tamm A. Schmidt R.E. Ann. Hematol. 1998; 76: 231-248Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar), and can bind monomeric IgG. In contrast, FcγRII and FcγRIII show a weaker affinity for monomeric IgG, Ka ≤ 107m−1 (14Gessner J.E. Heiken H. Tamm A. Schmidt R.E. Ann. Hematol. 1998; 76: 231-248Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar), and hence can only interact effectively with multimeric immune complexes. Given the interest in and increasing use of antibody therapeutics, a comprehensive mapping of the binding site on human IgG for the different FcγR could provide for alternative methods of either abrogating or enhancing immune recruitment via FcγR. Previous studies mapped the binding site on human and murine IgG for FcγR primarily to the lower hinge region composed of IgG residues 233–239 (Eu numbering, see Ref. 18Kabat E.A. Wu T.T. Perry H.M. Gottesman K.S. Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda1991Google Scholar) (8Duncan A.R. Woof J.M. Partridge L.J. Burton D.R. Winter G. Nature. 1988; 332: 563-564Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar, 14Gessner J.E. Heiken H. Tamm A. Schmidt R.E. Ann. Hematol. 1998; 76: 231-248Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar, 15Gavin A. Hulett M. Hogarth P.M. van de Winkel J.G.J. Hogarth P.M. The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity. Kluwer Academic Publishers Group, Dordrecht, The Netherlands1998: 11-35Crossref Google Scholar, 16Sautes C. Fridman W.H. Sautes C. Cell-mediated Effects of Immunoglobulins. R. G. Landes Co., Austin, TX1997: 29-66Crossref Google Scholar, 17Da'ron M. Annu. Rev. Immunol. 1997; 15: 203-234Crossref PubMed Scopus (1050) Google Scholar, 19Canfield S.M. Morrison S.L. J. Exp. Med. 1991; 173: 1483-1491Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar, 20Chappel M.S. Isenman D.E. Everett M. Xu Y.-Y. Dorrington K.J. Klein M.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 9036-9040Crossref PubMed Scopus (119) Google Scholar, 21Woof J.M. Partridge L.J. Jefferis R. Burton D.R. Mol. Immunol. 1986; 23: 319-330Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 22Wines B.D. Powell M.S. Parren P.W.H.I. Barnes N. Hogarth P.M. J. Immunol. 2000; 164: 5313-5318Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). Other studies proposed additional broad segments, e.g.Gly316–Lys338 for human FcγRI (21Woof J.M. Partridge L.J. Jefferis R. Burton D.R. Mol. Immunol. 1986; 23: 319-330Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar), Lys274–Arg301 and Tyr407–Arg416 for human FcγRIII (23Sarmay G. Benzcur M. Petranyi G. Klein E. Kahn M. Stanworth D.R. Gergely J. Mol. Immunol. 1984; 21: 43-51Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar, 24Gergely J. Sandor M. Sarmay G. Uher F. Biochem. Soc. Trans. 1984; 12: 739-743Crossref PubMed Scopus (4) Google Scholar), or found few specific residues outside the lower hinge, e.g.Asn297 and Glu318 for murine IgG2b interacting with murine FcγRII (25Lund J. Pound J.D. Jones P.T. Duncan A.R. Bentley T. Goodall M. Levine B.A. Jefferis R. Winter G. Mol. Immunol. 1992; 29: 53-59Crossref PubMed Scopus (48) Google Scholar). The very recent report of the 3.2-Å crystal structure of the human IgG1 Fc fragment with human FcγRIIIA delineated IgG1 residues Leu234–Ser239, Asp265–Glu269, Asn297–Thr299, and Ala327–Ile332 as involved in binding to FcγRIIIA (26Sondermann P. Huber R. Oosthuizen V. Jacob U. Nature. 2000; 406: 267-273Crossref PubMed Scopus (606) Google Scholar). The current study provides a complete, high resolution mapping of human IgG1 for human FcγR receptors (FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) as well as for human FcRn, an Fc receptor belonging to the major histocompatability complex structural class, which is involved in IgG transport and clearance (27Raghavan M. Bjorkman P.J. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996; 12: 181-220Crossref PubMed Scopus (268) Google Scholar, 28Ward E.S. Ghetie V. Ther. Immunol. 1995; 2: 77-94PubMed Google Scholar). The binding site on human IgG1 for the various receptors was determined by individually changing all solvent-exposed amino acids in human IgG1 CH2 and CH3 domains, based on the crystal structure of human IgG1 Fc (30Deisenhofer J. Biochemistry. 1981; 20: 2361-2370Crossref PubMed Scopus (1365) Google Scholar), to Ala. A common set of IgG1 residues is involved in binding to all FcγR; FcγRII and FcγRIII also utilize distinct residues in addition to this common set. As well as residues that abrogated binding to one or more Fc receptors when changed to Ala, several positions were found that improved binding only to specific receptors or simultaneously improved binding to one type of FcγR and reduced binding to another type. Notably, for both FcγRIIIA and FcRn, which have crystal structures of complexes with IgG available (26Sondermann P. Huber R. Oosthuizen V. Jacob U. Nature. 2000; 406: 267-273Crossref PubMed Scopus (606) Google Scholar, 29Burmeister W.P. Huber A.H. Bjorkman P.J. Nature. 1994; 372: 379-383Crossref PubMed Scopus (415) Google Scholar), several IgG residues not found at the IgG:receptor interface had a profound effect on binding and biological activity. Select IgG1 variants with improved binding to FcγRIIIA showed an enhancement in ADCC when either peripheral blood monocyte cells (PBMC) or natural killer cells (NK) were used. These variants may have important implications for using Fc-engineered antibodies for improved therapeutic efficacy. The cDNAs encoding extracellular and transmembrane domains of human FcγRIIA (CD32A; His131 allotype), FcγRIIB (CD32B), and FcγRIIIA (CD16A; Val158 allotype) were provided by Dr. J. Ravetch (Rockefeller University, New York). FcγRIIA-Arg131 allotype and FcγRIIIA-Phe158allotype were generated by site-directed mutagenesis (31Kunkel T.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985; 82: 488-492Crossref PubMed Scopus (4903) Google Scholar). The cDNA for FcγRI (CD64) was isolated by reverse transcriptase-PCR (GeneAmp, PerkinElmer Life Sciences) of oligo(dT)-primed RNA from U937 cells using primers that generated a fragment encoding the α-chain extracellular domain. The cDNAs encoding human neonatal Fc receptor (FcRn) α-chain, β2-microglobulin subunit, and human FcγR γ-chain were obtained from the I.M.A.G.E. Consortium (32Lennon G.G. Auffray C. Polymeropoulos M. Soares M.B. Genomics. 1996; 33: 151-152Crossref PubMed Scopus (1089) Google Scholar). The coding regions of all receptors were subcloned into previously described pRK mammalian cell expression vectors (33Eaton D.L. Wood W.I. Eaton D. Hass P.E. Hollingshead P. Wion K. Mather J. Lawn R.M. Vehar G.A. Gorman C. Biochemistry. 1986; 25: 8343-8347Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar). For all FcγR and the FcRn α-chain pRK plasmids, the transmembrane and intracellular domains were replaced by DNA encoding a Gly-His6 tag and human glutathione S-transferase (GST). The 234-amino acid GST sequence was obtained by PCR from the pGEX-4T2 plasmid (Amersham Pharmacia Biotech) with NheI andXbaI restriction sites at the 5′ and 3′ ends, respectively. Thus, the expressed proteins contained the extracellular domains of the α-chain fused at their carboxyl termini to Gly/His6/GST at amino acid positions as follows: FcγRI, His292; FcγRIIA, Met216; FcγRIIB, Met195; FcγRIIIA, Gln191; FcRn, Ser297 (residue numbers include signal peptides). Plasmids were transfected into the adenovirus-transformed human embryonic kidney cell line 293 by calcium phosphate precipitation (34Gorman C.M. Gies D.R. McCray G. DNA Protein Eng. Tech. 1990; 2: 3-10Google Scholar). Supernatants were collected 72 h after conversion to serum-free PSO4 medium supplemented with 10 mg/liter recombinant bovine insulin, 1 mg/liter human transferrin, and trace elements. Proteins were purified by nickel-nitrilotriacetic acid chromatography (Qiagen, Valencia, CA) and buffer exchanged into phosphate-buffered saline (PBS) using Centriprep-30 concentrators (Millipore, Bedford, MA). Proteins were analyzed on 4–20%SDS-polyacrylamide gels (NOVEX, San Diego, CA), transferred to polyvinylidene difluoride membranes (NOVEX), and their amino termini sequenced to ensure proper signal sequence cleavage. Receptor conformation was evaluated by ELISA using murine monoclonals 32.2 (anti-FcγRI), IV.3 (anti-FcγRII), 3G8 (anti-FcγRIII) (Medarex, Annandale, NJ), and B1G6 (anti-β2-microglobulin) (Beckman Coulter, Palo Alto, CA). Receptor concentrations were determined by amino acid analysis. The humanized IgG1 anti-IgE E27, an affinity-matured variant of anti-IgE E25, binds to the Fcε3 domain of human IgE (35Presta L.G. Lahr S.J. Shields R.L. Porter J.P. Gorman C.M. Jardieu P.M. J. Immunol. 1993; 151: 2623-2632PubMed Google Scholar). When mixed with human IgE in a 1:1 molar ratio, the IgE and anti-IgE form a hexameric complex composed of three IgE and three anti-IgE (36Liu J. Lester P. Builder S. Shire S.J. Biochemistry. 1995; 34: 10474-10482Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar). Site-directed mutagenesis (31Kunkel T.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985; 82: 488-492Crossref PubMed Scopus (4903) Google Scholar) on E27 IgG1 was used to generate IgG1 variants in which all solvent-exposed residues in the CH2 and CH3 domains were individually altered to Ala; selection of solvent-exposed residues was based on the crystal structure of human IgG1 Fc (30Deisenhofer J. Biochemistry. 1981; 20: 2361-2370Crossref PubMed Scopus (1365) Google Scholar). Human IgG2, IgG3, and IgG4 isotypes of E27 were constructed by subcloning the appropriate heavy chain Fc cDNAs from a human spleen cDNA library into a pRK vector containing the E27 variable heavy domain. All IgG isotypes and variants were expressed using the same E27 κ light chain. Following cotransfection of heavy and light chain plasmids into 293 cells, IgG1, IgG2, IgG4, and variants were purified by protein A chromatography (Amersham Pharmacia Biotech). IgG3 isotype was purified using protein G chromatography (Amersham Pharmacia Biotech). All proteins were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Protein concentrations were determined usingA280 and verified using amino acid composition analysis and a human IgG Fc ELISA. IgGs were also tested for their binding to human IgE in an ELISA format to ensure that they bound IgE as well as native E27. Structural integrity of the variants was also evident by their ability to be purified using protein A (which binds at the CH2:CH3 domain interface (30Deisenhofer J. Biochemistry. 1981; 20: 2361-2370Crossref PubMed Scopus (1365) Google Scholar)) as well as all variants, except P329A, binding similar to native IgG1 to at least one of the five receptors. FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA fusion proteins at 1 μg/ml in PBS, pH 7.4, were coated onto ELISA plates (Nalge-Nunc, Naperville, IL) for 48 h at 4 °C. Plates were blocked with Tris-buffered saline, 0.5%bovine serum albumin, 0.05%polysorbate-20, 2 mm EDTA, pH 7.45 (assay buffer), at 25 °C for 1 h. E27-IgE hexameric complexes were prepared in assay buffer by mixing equimolar amounts of E27 and human myeloma IgE (37Nilsson K. Bennich H. Johansson S.G.O. Ponten J. Clin. Exp. Immunol. 1970; 7: 477-489PubMed Google Scholar) at 25 °C for 1 h. Serial 3-fold dilutions of native E27 standard or variant complexes (10.0–0.0045 μg/ml) were added to plates and incubated for 2 h. After washing plates with assay buffer, bound complexes to FcγRIIA and FcγRIIB were detected with peroxidase-conjugated F(ab′)2 fragment of goat anti-human F(ab′)2-specific IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Binding of complexes to FcγRIIIA was detected with peroxidase-conjugated protein G (Bio-Rad). The substrate used was o-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma). Absorbance at 490 nm was read using a Vmax plate reader (Molecular Devices, Mountain View, CA). Any contribution to binding via interaction of the IgE in the E27-IgE complexes with the human FcγRII and FcγRIIIA was not apparent based on the lack of binding of several Ala variants (Class 1, Table I).Table IBinding of human IgG1 variants to human FcRn and FcγRVariant1-aResidue numbers are according to the Eu numbering system (18). Variants that had no effect on binding (i.e. did not reduce binding by more than 60%or improve binding by more than 20%) to FcγR or FcRn were as follows: Lys246, Lys248, Asp249, Met252, Thr260, Lys274, Tyr278, Val282, Glu283, Thr289, Glu294, Y300F, Glu318, Lys320, Ser324, A330Q, Thr335, Lys340, Gln342, Arg344, Glu345, Gln347, Arg355, Glu356, Met358, Thr359, Lys360, Asn361, Tyr373, Ser375, Ser383, Asn384, Gln386, Glu388, Asn389, Asn390, Y391F, Lys392, Leu398, Ser400, Asp401, Asp413, Arg416, Gln418, Gln419, Asn421, Val422, Thr437, Gln438, Lys439, Ser440, Ser442, Ser444, and Lys447.FcRn1-bValues are the ratio of binding of the variant to that of native IgG1 at 0.33 or 1 μg/ml. A value greater than 1 denotes binding of the variant was improved compared with native IgG1, whereas a ratio less than 1 denotes reduced binding compared with native IgG1. Reduced binding to any given receptor was defined as a reduction of ≥40%compared to native IgG; better binding was defined as an improvement of ≥25%compared with native IgG1.mean(S.D.)nFcγRI mean(S.D.)nFcγRIIA mean(S.D.)FcγRIIB mean(S.D.)FcγRIIIA mean(S.D.)n1-cNumber of independent assays for FcγRIIA, FcγRIIB and FcγRIIIA. At least two separately expressed and purified lots of each variant were assayed.Class 1, reduced binding to all FcγRE233P0.54 (0.20) 30.12 (0.06) 60.08 (0.01)0.12 (0.01)0.04 (0.02)2L234VL235AG236 deletedP238A1.49 (0.17) 30.60 (0.05) 50.38 (0.14)0.36 (0.15)0.07 (0.05)4D265A1.23 (0.14) 40.16 (0.05) 90.07 (0.01)0.13 (0.05)0.09 (0.06)4N297A0.80 (0.18) 80.15 (0.06) 70.05 (0.00)0.10 (0.02)0.03 (0.01)3A327Q0.970.60 (0.12) 90.13 (0.03)0.14 (0.03)0.06 (0.01)4P329A0.800.48 (0.10) 60.08 (0.02)0.12 (0.08)0.21 (0.03)4Class 2, reduced binding to FcγRII and FcγRIIIAD270A1.050.76 (0.12) 60.06 (0.02)0.10 (0.06)0.14 (0.04)6Q295A0.791.00 (0.11) 40.62 (0.20)0.50 (0.24)0.25 (0.09)5A327S0.86 (0.03) 40.23 (0.06)0.22 (0.05)0.06 (0.01)4Class 3, improved binding to FcγRII and FcγRIIIAT256A1.91 (0.43) 61.01 (0.07) 51.41 (0.27)2.06 (0.66)1.32 (0.18)9K290A0.79 (0.14) 31.01 (0.06) 111.30 (0.21)1.38 (0.17)1.31 (0.19)9Class 4, improved binding to FcγRII and no effect on FcγRIIIAR255A0.59 (0.19) 40.99 (0.12) 71.30 (0.20)1.59 (0.42)0.98 (0.18)5E258A1.181.18 (0.13) 41.33 (0.22)1.65 (0.38)1.12 (0.12)5S267A1.081.09 (0.08) 101.52 (0.22)1.84 (0.43)1.05 (0.24)11E272A1.34 (0.24) 41.05 (0.06) 71.23 (0.12)1.53 (0.22)0.80 (0.18)6N276A1.15 (0.21) 31.05 (0.14) 41.29 (0.20)1.34 (0.40)0.95 (0.04)4D280A0.821.04 (0.08) 101.34 (0.14)1.60 (0.31)1.09 (0.20)10H285A0.850.96 (0.07) 41.26 (0.12)1.23 (0.15)0.87 (0.04)4N286A1.24 (0.04) 20.95 (0.18) 161.24 (0.23)1.36 (0.15)1.05 (0.04)6T307A1.81 (0.32) 60.99 (0.14) 41.07 (0.15)1.27 (0.24)1.09 (0.18)10L309A0.63 (0.18) 40.93 (0.18) 61.13 (0.08)1.26 (0.12)1.07 (0.20)3N315A0.76 (0.14) 30.99 (0.16) 61.15 (0.06)1.30 (0.17)1.07 (0.21)5K326A1.031.03 (0.05) 101.23 (0.20)1.41 (0.27)1.23 (0.23)7P331A0.851.01 (0.09) 71.29 (0.14)1.34 (0.35)1.08 (0.19)4S337A1.031.17 (0.23) 31.22 (0.30)1.26 (0.06)0.94 (0.18)4A378Q1.32 (0.13) 31.06 (0.05) 31.40 (0.17)1.45 (0.17)1.19 (0.17)5E430A0.93 (0.03) 21.05 (0.02) 31.24 (0.11)1.28 (0.10)1.20 (0.18)5Class 5, improved binding to FcγRII and reduced binding to FcγRIIIAH268A1.02 (0.22) 31.09 (0.11) 81.21 (0.14)1.44 (0.22)0.54 (0.12)13R301A0.861.06 (0.10) 41.14 (0.13)1.29 (0.16)0.22 (0.08)7K322A0.980.94 (0.04) 91.17 (0.11)1.28 (0.21)0.62 (0.12)6Class 6, reduced binding to FcγRII and no effect on FcγRIIIAR292A0.81 (0.18) 40.95 (0.05) 80.27 (0.13)0.17 (0.07)0.89 (0.17)10K414A1.021.00 (0.04) 30.64 (0.15)0.58 (0.18)0.82 (0.27)3Class 7, reduced binding to FcγRII and improved binding to FcγRIIIAS298A0.801.11 (0.03) 90.40 (0.15)0.23 (0.13)1.34 (0.20)16Class 8, no effect on FcγRII and reduced binding to FcγRIIIAS239A1.060.81 (0.09) 70.73 (0.25)0.76 (0.36)0.26 (0.08)3E269A1.050.61 (0.14) 90.65 (0.18)0.75 (0.29)0.45 (0.13)5E293A0.851.11 (0.07) 41.08 (0.19)1.07 (0.20)0.31 (0.13)6Y296F0.791.03 (0.09) 80.97 (0.23)0.86 (0.17)0.55 (0.12)6V303A1.26 (0.21) 30.91 (0.11) 50.86 (0.10)0.65 (0.17)0.33 (0.09)8A327G0.96 (0.01) 30.92 (0.09)0.83 (0.10)0.36 (0.05)3K338A1.140.90 (0.05) 30.78 (0.09)0.63 (0.08)0.15 (0.01)2D376A1.45 (0.36) 41.00 (0.05) 30.80 (0.16)0.68 (0.14)0.55 (0.10)5Class 9, no effect on FcγRII and improved binding to FcγRIIIAE333A1.03 (0.01) 20.98 (0.15) 50.92 (0.12)0.76 (0.11)1.27 (0.17)10K334A1.05 (0.03) 21.06 (0.06) 111.01 (0.15)0.90 (0.12)1.39 (0.19)16A339T1.06 (0.04) 61.09 (0.03)1.20 (0.03)1.34 (0.09)2Class 10, affect only FcRnI253A<0.100.96 (0.05) 41.14 (0.02)1.18 (0.06)1.08 (0.14)3S254A<0.100.96 (0.08) 40.97 (0.24)1.15 (0.38)0.73 (0.14)3K288A0.38 (0.12) 50.88 (0.15) 151.15 (0.26)1.14 (0.20)1.06 (0.04)4V305A1.46 (0.48) 61.04 (0.19) 101.12 (0.12)1.23 (0.22)0.84 (0.15)4Q311A1.62 (0.25) 40.93 (0.05) 41.11 (0.06)1.19 (0.13)0.93 (0.17)3D312A1.50 (0.06) 41.01 (0.12) 51.20 (0.24)1.19 (0.07)1.23 (0.14)3K317A1.44 (0.18) 40.92 (0.17) 61.13 (0.05)1.18 (0.27)1.10 (0.23)4K360A1.30 (0.08) 41.02 (0.04) 31.12 (0.10)1.12 (0.08)1.23 (0.16)6Q362A1.25 (0.24) 31.00 (0.04) 31.03 (0.10)1.02 (0.03)1.03 (0.16)4E380A2.19 (0.29) 61.04 (0.06) 31.18 (0.01)1.07 (0.05)0.92 (0.12)2E382A1.51 (0.18) 41.06 (0.03) 30.95 (0.11)0.84 (0.04)0.76 (0.17)3S415A0.441.04 (0.03) 30.90 (0.11)0.88 (0.05)0.86 (0.18)2S424A1.41 (0.14) 30.98 (0.03) 31.04 (0.06)1.02 (0.02)0.88 (0.09)2H433A0.41 (0.14) 20.98 (0.03) 30.92 (0.18)0.79 (0.18)1.02 (0.15)3N434A3.46 (0.37) 71.00 (0.04) 30.96 (0.06)0.97 (0.12)0.77 (0.13)6H435A<0.10 41.25 (0.09) 30.77 (0.05)0.72 (0.05)0.78 (0.03)3Y436A<0.10 20.99 (0.02) 20.93 (0.05)0.91 (0.06)0.91 (0.15)31-a Residue numbers are according to the Eu numbering system (18Kabat E.A. Wu T.T. Perry H.M. Gottesman K.S. Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda1991Google Scholar). Variants that had no effect on binding (i.e. did not reduce binding by more than 60%or improve binding by more than 20%) to FcγR or FcRn were as follows: Lys246, Lys248, Asp249, Met252, Thr260, Lys274, Tyr278, Val282, Glu283, Thr289, Glu294, Y300F, Glu318, Lys320, Ser324, A330Q, Thr335, Lys340, Gln342, Arg344, Glu345, Gln347, Arg355, Glu356, Met358, Thr359, Lys360, Asn361, Tyr373, Ser375, Ser383, Asn384, Gln386, Glu388, Asn389, Asn390, Y391F, Lys392, Leu398, Ser400, Asp401, Asp413, Arg416, Gln418, Gln419, Asn421, Val422, Thr437, Gln438, Lys439, Ser440, Ser442, Ser444, and Lys447.1-b Values are the ratio of binding of the variant to that of native IgG1 at 0.33 or 1 μg/ml. A value greater than 1 denotes binding of the variant was improved compared with native IgG1, whereas a ratio less than 1 denotes reduced binding compared with native IgG1. Reduced binding to any given receptor was defined as a reduction of ≥40%compared to native IgG; better binding was defined as an improvement of ≥25%compared with native IgG1.1-c Number of independent assays for FcγRIIA, FcγRIIB and FcγRIIIA. At least two separately expressed and purified lots of each variant were assayed. Open table in a new tab For the high affinity FcγRI, the receptor fusion protein at 1.5 μg/ml in PBS, pH 7.4, was coated onto ELISA plates (Nunc) for 18 h at 4 °C. Plates were blocked with assay buffer at 25 °C for 1 h. Serial 3-fold dilutions of monomeric E27 and variants (10.0–0.0045 μg/ml) were added to plates and incubated for 2 h. After washing plates with assay buffer, IgG bound to FcγRI was detected with peroxidase-conjugated F(ab′)2 fragment of goat anti-human F(ab′)2-specific IgG (Jackson ImmunoResearch) or with peroxidase-conjugated protein G (Bio-Rad). The substrate used was o-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma). Absorbance at 490 nm was read using aVmax plate reader (Molecular Devices). For all FcγR, binding values reported are the binding of each E27 variant relative to native E27, taken as (A490 nm(variant)/A490 nm(native IgG1)) at 0.33 or 1 μg/ml for FcγRII and FcγRIIIA and 2 μg/ml for FcγRI. A value greater than 1 denotes binding of the variant was improved compared with native IgG1, whereas a ratio less than 1 denotes reduced binding compared with native IgG1. Reduced binding to any given receptor was defined as a reduction of ≥40%compared with native IgG; better binding was defined as an improvement of ≥25%compared with native IgG1. The latter was chosen based on the observation that variants with ≥25%improved binding in the ELISA format assay, such as E333A, K334A, and S298A, also showed improved efficacy in the cell-based binding and ADCC assays. ELISA plates (Nunc) were coated with 2 μg/ml NeutrAvidin (Pierce) or streptavidin (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA) in 50 mmcarbonate buffer, pH 9.6, at 4 °C overnight (the same results were obtained with either molecule). Plates were blocked with PBS, 0.5%BSA, 10 ppm Proclin 300 (Supelco, Bellefonte, PA), pH 7.2, at 25 °C for 1 h. FcRn-Gly-His6-GST was biotinylated using a standard protocol with biotin-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH) and bound to NeutrAvidin-coated plates at 2 μg/ml in PBS, 0.5%BSA, 0.05%polysorbate-20 (sample buffer), pH 7.2, at 25 °C for 1 h. Plates were then rinsed with sample buffer, pH 6.0. Eight serial 2-fold dilutions of E27 standard or variants (1.6–200 ng/ml) in sample buffer at pH 6.0 were incubated for 2 h. Plates were rinsed with sample buffer, pH 6.0, and bound IgG was detected with peroxidase-conjugated goat F(ab′)2 anti-human IgG F(ab′)2 (Jackson ImmunoResearch) in pH 6.0 sample buffer using 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) as substrate. Absorbance at 450 nm was read on aVmax plate reader (Molecular Devices). Titration curves were analyzed by a four-parameter nonlinear regression fit (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA). For each ELISA plate assay, a full titration curve of E27 standard was done. The absorbance at the midpoint of the titration curve (mid-OD) and its corresponding E27 concentration were determined. Then the concentration of each variant at this mid-OD was determined, and the concentration of E27 was divided by the concentration of each variant. Hence, the values are a ratio of the binding of each variant relative to native IgG1 standard. A control human IgG1 was run on each ELISA plate as a control and had a ratio of 1.12 ± 0.07 (n = 92). A second format was

The human endometrium undergoes a complex process of vascular and glandular proliferation, differentiation, and regeneration with each menstrual cycle in preparation for implantation. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an endothelial cell-specific angiogenic protein that appears to play an important role in both physiological and pathological neovascularization. To investigate whether VEGF may regulate human endometrial angiogenesis, we examined VEGF messenger ribonucleic acid (mRNA) and protein throughout the menstrual cycle and studied the regulation of VEGF by reproductive steroids in isolated human endometrial cells. By ribonuclease protection analysis, VEGF mRNA increased relative to early proliferative phase expression by 1.6-,2.0-, and 3.6-fold in midproliferative, late proliferative, and secretory endometrium, respectively. In histological sections, VEGF mRNA and protein were localized focally in glandular epithelial cells and more diffusely in surrounding stroma, with greatest VEGF expression in secretory endometrium. Consistent with these in vivo results, the treatment of isolated human endometrial cells with estradiol (E2), medroxyprogesterone acetate (MPA), or E2 plus MPA significantly increased VEGF mRNA expression over the control value by 3.1-, 2.8-, and 4.7-fold, respectively. The VEGF response to E2 was rapid, with steady state levels of VEGF mRNA reaching 85% maximum 1 h after the addition of steroid. E2 also caused a 46% increase in secreted VEGF protein, and the combination of E2 and MPA caused an 18% increase. VEGF expression in endometriosis, an angiogenesis-dependent, estrogen-sensitive disease was similar to that seen in eutopic endometrium. Peritoneal fluid concentrations of VEGF were significantly higher in women with moderate to severe endometriosis than in women with minimal to mild endometriosis or no disease. VEGF, therefore, may be important in both physiological and pathological angiogenesis of human endometrium, as it is an estrogen-responsive angiogenic factor that varies throughout the menstrual cycle and is elevated in women with endometriosis.

Priming of the organ-specific premetastatic sites is thought to be an important yet incompletely understood step during metastasis. In this study, we show that the metastatic tumors we examined overexpress granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), which expands and mobilizes Ly6G+Ly6C+ granulocytes and facilitates their subsequent homing at distant organs even before the arrival of tumor cells. Moreover, G-CSF-mobilized Ly6G+Ly6C+ cells produce the Bv8 protein, which has been implicated in angiogenesis and mobilization of myeloid cells. Anti-G-CSF or anti-Bv8 antibodies significantly reduced lung metastasis. Transplantation of Bv8 null fetal liver cells into lethally irradiated hosts also reduced metastasis. We identified an unexpected role for Bv8: the ability to stimulate tumor cell migration through activation of one of the Bv8 receptors, prokineticin receptor (PKR)-1. Finally, we show that administration of recombinant G-CSF is sufficient to increase the numbers of Ly6G+Ly6C+ cells in organ-specific metastatic sites and results in enhanced metastatic ability of several tumors.

Abstract B cell immunotherapy has emerged as a mainstay in the treatment of lymphomas and autoimmune diseases. Although the microenvironment has recently been demonstrated to play critical roles in B cell homeostasis, its contribution to immunotherapy is unknown. To analyze the in vivo factors that regulate mechanisms involved in B cell immunotherapy, we used a murine model for human CD20 (hCD20) expression in which treatment of hCD20+ mice with anti-hCD20 mAbs mimics B cell depletion observed in humans. We demonstrate in this study that factors derived from the microenvironment, including signals from the B cell-activating factor belonging to the TNF family/BLyS survival factor, integrin-regulated homeostasis, and circulatory dynamics of B cells define distinct in vivo mechanism(s) and sensitivities of cells in anti-hCD20 mAb-directed therapies. These findings provide new insights into the mechanisms of immunotherapy and define new opportunities in the treatment of cancers and autoimmune diseases.

Recent studies suggest that tumor-associated CD11b(+)Gr1(+) myeloid cells contribute to refractoriness to antiangiogenic therapy with an anti-VEGF-A antibody. However, the mechanisms of peripheral mobilization and tumor-homing of CD11b(+)Gr1(+) cells are unclear. Here, we show that, compared with other cytokines [granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), stromal derived factor 1alpha, and placenta growth factor], G-CSF and the G-CSF-induced Bv8 protein have preferential expression in refractory tumors. Treatment of refractory tumors with the combination of anti-VEGF and anti-G-CSF (or anti-Bv8) reduced tumor growth compared with anti-VEGF-A monotherapy. Anti-G-CSF treatment dramatically suppressed circulating or tumor-associated CD11b(+)Gr1(+) cells, reduced Bv8 levels, and affected the tumor vasculature. Conversely, G-CSF delivery to animals bearing anti-VEGF sensitive tumors resulted in reduced responsiveness to anti-VEGF-A treatment through induction of Bv8-dependent angiogenesis. We conclude that, at least in the models examined, G-CSF expression by tumor or stromal cells is a determinant of refractoriness to anti-VEGF-A treatment.

Abstract Rituxan (Rituximab) is a chimeric mAb with human IgG1 constant domains used in the therapy of non-Hodgkin’s B cell lymphomas. This Ab targets B cells by binding to the cell-surface receptor, CD20. In our investigation of the mechanism of B cell depletion mediated by Rituximab, we first constructed mutants of Rituximab defective in complement activation but with all other effector functions intact. Our results demonstrate that the previously described C1q binding motif in murine IgG2b constituting residues E318, K320, and K322 is not applicable to a human IgG1 when challenged with either human, rabbit, or guinea pig complement. Alanine substitution at positions E318 and K320 in Rituximab had little or no effect on C1q binding and complement activation, whereas alanine substitution at positions D270, K322, P329, and P331 significantly reduced the ability of Rituximab to bind C1q and activate complement. We have also observed that concentrations of complement approaching physiological levels are able to rescue &gt;60% of the activity of these mutant Abs with low affinity for C1q. These data localize the C1q binding epicenter on human IgG1 and suggest that there are species-specific differences in the C1q binding site of Igs.

Although angiogenesis inhibitors have provided substantial clinical benefit as cancer therapeutics, their use is limited by resistance to their therapeutic effects. While ample evidence indicates that such resistance can be influenced by the tumor microenvironment, the underlying mechanisms remain incompletely understood. Here, we have uncovered a paracrine signaling network between the adaptive and innate immune systems that is associated with resistance in multiple tumor models: lymphoma, lung and colon. Tumor-infiltrating T helper type 17 (T(H)17) cells and interleukin-17 (IL-17) induced the expression of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) through nuclear factor κB (NF-κB) and extracellular-related kinase (ERK) signaling, leading to immature myeloid-cell mobilization and recruitment into the tumor microenvironment. The occurrence of T(H)17 cells and Bv8-positive granulocytes was also observed in clinical tumor specimens. Tumors resistant to treatment with antibodies to VEGF were rendered sensitive in IL-17 receptor (IL-17R)-knockout hosts deficient in T(H)17 effector function. Furthermore, pharmacological blockade of T(H)17 cell function sensitized resistant tumors to therapy with antibodies to VEGF. These findings indicate that IL-17 promotes tumor resistance to VEGF inhibition, suggesting that immunomodulatory strategies could improve the efficacy of anti-angiogenic therapy.