Postmenopausal osteoporosis and rheumatoid joint destruction result from increased osteoclast formation and bone resorption induced by receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) and tumor necrosis factor (TNF). Osteoclast formation induced by these cytokines requires NF-κB p50 and p52, c-Fos, and NFATc1 expression in osteoclast precursors. c-Fos induces NFATc1, but the relationship between NF-κB and these other transcription factors in osteoclastogenesis remains poorly understood. We report that RANKL and TNF can induce osteoclast formation directly from NF-κB p50/p52 double knockout (dKO) osteoclast precursors when either c-Fos or NFATc1 is expressed. RANKL- or TNF-induced c-Fos up-regulation and activation are abolished in dKO cells and in wild-type cells treated with an NF-κB inhibitor. c-Fos expression requires concomitant RANKL or TNF treatment to induce NFATc1 activation in the dKO cells. Furthermore, c-Fos expression increases the number and resorptive capacity of wild-type osteoclasts induced by TNF in vitro. We conclude that NF-κB controls early osteoclast differentiation from precursors induced directly by RANKL and TNF, leading to activation of c-Fos followed by NFATc1. Inhibition of NF-κB should prevent RANKL- and TNF-induced bone resorption. Postmenopausal osteoporosis and rheumatoid joint destruction result from increased osteoclast formation and bone resorption induced by receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) and tumor necrosis factor (TNF). Osteoclast formation induced by these cytokines requires NF-κB p50 and p52, c-Fos, and NFATc1 expression in osteoclast precursors. c-Fos induces NFATc1, but the relationship between NF-κB and these other transcription factors in osteoclastogenesis remains poorly understood. We report that RANKL and TNF can induce osteoclast formation directly from NF-κB p50/p52 double knockout (dKO) osteoclast precursors when either c-Fos or NFATc1 is expressed. RANKL- or TNF-induced c-Fos up-regulation and activation are abolished in dKO cells and in wild-type cells treated with an NF-κB inhibitor. c-Fos expression requires concomitant RANKL or TNF treatment to induce NFATc1 activation in the dKO cells. Furthermore, c-Fos expression increases the number and resorptive capacity of wild-type osteoclasts induced by TNF in vitro. We conclude that NF-κB controls early osteoclast differentiation from precursors induced directly by RANKL and TNF, leading to activation of c-Fos followed by NFATc1. Inhibition of NF-κB should prevent RANKL- and TNF-induced bone resorption. Osteoclasts are specialized bone-resorbing cells derived from multipotent myeloid progenitor cells. They play a crucial homeostatic role in skeletal modeling and remodeling and destroy bone in many pathologic conditions (1Boyle W.J. Simonet W.S. Lacey D.L. Nature. 2003; 423: 337-342Crossref PubMed Scopus (4851) Google Scholar, 2Teitelbaum S.L. J. Bone Miner. Metab. 2000; 18: 344-349Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar). Understanding of the regulation of osteoclast formation, activation, and survival has increased dramatically in recent years following the identification of osteoprotegerin and of receptor activator of NF-κB (RANK) 3The abbreviations used are: RANK, receptor activator of NF-κB; RANKL, RANK ligand; TNF, tumor necrosis factor; dKO, double knock-out; WT, wild type; M-CSF, macrophage colony-stimulating factor; MDS, M-CSF-dependent splenocytes; GFP, green fluorescent protein; RT, reverse transcription; NFAT, nuclear factor of activated T cells; PBS, phosphate-buffered saline; EMSA, electrophoretic mobility shift assay. 3The abbreviations used are: RANK, receptor activator of NF-κB; RANKL, RANK ligand; TNF, tumor necrosis factor; dKO, double knock-out; WT, wild type; M-CSF, macrophage colony-stimulating factor; MDS, M-CSF-dependent splenocytes; GFP, green fluorescent protein; RT, reverse transcription; NFAT, nuclear factor of activated T cells; PBS, phosphate-buffered saline; EMSA, electrophoretic mobility shift assay. and its ligand, RANKL (3Lacey D.L. Timms E. Tan H.L. Kelley M.J. Dunstan C.R. Burgess T. Elliott R. Colombero A. Elliott G. Scully S. Hsu H. Sullivan J. Hawkins N. Davy E. Capparelli C. Eli A. Qian Y.X. Kaufman S. Sarosi I. Shalhoub V. Senaldi G. Guo J. Delaney J. Boyle W.J. Cell. 1998; 93: 165-176Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4596) Google Scholar, 4Dougall W.C. Glaccum M. Charrier K. K R. Brasel K. Smedt T. Daro E. Smith J. Tometsko M.E. Maliszewski C.R. Armstrong A. Shen V. Bain S. Cosman D. Anderson D. Morrissey P.J. P. J.J. Schuh J. Genes Dev. 1999; 13: 2412-2424Crossref PubMed Scopus (1192) Google Scholar, 5Simonet W.S. Lacey D.L. Dunstan C.R. Kelley M. Chang M.S. Luthy R. Nguyen H.Q. Wooden S. Bennett L. Boone T. Shimamoto G. DeRose M. Elliott R. Colombero A. Tan H.L. Trail G. Sullivan J. Davy E. Bucay N. Renshaw-Gegg L. Hughes T.M. Hill D. Pattison W. Campbell P. Boyle W.J. Cell. 1997; 89: 309-319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4315) Google Scholar). RANKL is a member of the TNF superfamily (6Wong B.R. Rho J. Arron J. Robinson E. Orlinick J. Chao M. Kalachikov S. Cayani E. Bartlett III, F.S. Frankel W.N. Lee S.Y. Choi Y. J. Biol. Chem. 1997; 272: 25190-25194Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (913) Google Scholar, 7Kong Y.Y. Boyle W.J. Penninger J.M. Immunol. Cell Biol. 1999; 77: 188-193Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar). It is expressed by a variety of cell types, particularly osteoblast/stromal cells, and its expression by these cells increases in response to a variety of factors, including cytokines, growth factors, and hormones, to induce osteoclast formation, activation, and survival in normal and disease states (2Teitelbaum S.L. J. Bone Miner. Metab. 2000; 18: 344-349Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar, 8Goldring S.R. Calcif. Tissue Int. 2003; 73: 97-100Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar, 9Udagawa N. Kotake S. Kamatani N. Takahashi N. Suda T. Arthritis Res. 2002; 4: 281-289Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar). Osteoprotegerin is a decoy receptor for RANKL that negatively regulates bone resorption by binding to RANKL, and thus, preventing it binding to RANK on osteoclasts or their precursors. Thus, in many circumstances, osteoclast formation is regulated indirectly by accessory cells. In addition to passively responding to RANKL, osteoclasts also actively regulate their own formation, activation, and survival, both positively and negatively. For example, they produce both ligands (10O'Keefe R.J. Teot L.A. Singh D. Puzas J.E. Rosier R.N. Hicks D.G. Lab. Investig. 1997; 76: 457-465PubMed Google Scholar, 11Cappellen D. Luong-Nguyen N.H. Bongiovanni S. Grenet O. Wanke C. Susa M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21971-21982Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (164) Google Scholar) and receptors (12Jimi E. Nakamura I. Duong L.T. Ikebe T. Takahashi N. Rodan G.A. Suda T. Exp. Cell Res. 1999; 247: 84-93Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar, 13Kobayashi K. Takahashi N. Jimi E. Udagawa N. Takami M. Kotake S. Nakagawa N. Kinosaki M. Yamaguchi K. Shima N. Yasuda H. Morinaga T. Higashio K. Martin T.J. Suda T. J. Exp. Med. 2000; 191: 275-286Crossref PubMed Scopus (1070) Google Scholar, 14Dougall W.C. Glaccum M. Charrier K. Rohrbach K. Brasel K. De Smedt T. Daro E. Smith J. Tometsko M.E. Maliszewski C.R. Armstrong A. Shen V. Bain S. Cosman D. Anderson D. Morrissey P.J. Peschon J.J. Schuh J. Genes Dev. 1999; 13: 2412-2424Crossref PubMed Scopus (1083) Google Scholar) for positive regulatory cytokines, such as TNF and interleukin-1, as well as for interferon-β, which negatively regulates their formation (15Takayanagi H. Kim S. Matsuo K. Suzuki H. Suzuki T. Sato K. Yokochi T. Oda H. Nakamura K. Ida N. Wagner E.F. Taniguchi T. Nature. 2002; 416: 744-749Crossref PubMed Scopus (589) Google Scholar, 16Takayanagi H. Ogasawara K. Hida S. Chiba T. Murata S. Sato K. Takaoka A. Yokochi T. Oda H. Tanaka K. Nakamura K. Taniguchi T. Nature. 2000; 408: 600-605Crossref PubMed Scopus (1077) Google Scholar). TNF has been implicated in postmenopausal and inflammation-associated bone loss mainly by inducing expression of RANKL (8Goldring S.R. Calcif. Tissue Int. 2003; 73: 97-100Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar, 17Suda T. Kobayashi K. Jimi E. Udagawa N. Takahashi N. Novartis Found. Symp. 2001; 232: 235-250Crossref PubMed Google Scholar) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) (18Kitaura H. Zhou P. Kim H.J. Novack D.V. Ross F.P. Teitelbaum S.L. J. Clin. Investig. 2005; 115: 3418-3427Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar, 19Tanabe N. Maeno M. Suzuki N. Fujisaki K. Tanaka H. Ogiso B. Ito K. Life Sci. 2005; 77: 615-626Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar) by accessory cells. By this mechanism, these cytokines indirectly increase osteoclastogenesis. In addition, TNF increases expression of RANK and c-Fms on the surface of osteoclast precursors to amplify RANKL and M-CSF signaling (20Yao Z. Li P. Zhang Q. Schwarz E.M. Keng P. Arbini A. Boyce B.F. Xing L. J. Biol. Chem. 2006; 281: 11846-11855Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (164) Google Scholar, 21Zhang Y.H. Heulsmann A. Tondravi M.M. Mukherjee A. Abu-Amer Y. J. Biol. Chem. 2001; 276: 563-568Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (416) Google Scholar). TNF also induces activation of the transcription factors NF-κB, AP-1, and nuclear factor of activated T cells c1 (NFATc1, also known as NFAT2) in osteoclast precursors (reviewed in Refs. 1Boyle W.J. Simonet W.S. Lacey D.L. Nature. 2003; 423: 337-342Crossref PubMed Scopus (4851) Google Scholar and 22Boyce B.F. Yamashita T. Yao Z. Zhang Q. Li F. Xing L. J. Bone Miner. Metab. 2005; 23: 11-15Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar, 23Karsenty G. Wagner E.F. Dev. Cell. 2002; 2: 389-406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1190) Google Scholar), thereby directly controlling the differentiation of these precursors to osteoclasts (24Takayanagi H. J. Mol. Med. 2005; 83: 170-179Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar, 25Kong Y.Y. Yoshida H. Sarosi I. Tan H.L. Timms E. Capparelli C. Morony S. Oliveira-dos-Santos A.J. Van G. Itie A. Khoo W. Wakeham A. Dunstan C.R. Lacey D.L. Mak T.W. Boyle W.J. Penninger J.M. Nature. 1999; 397: 315-323Crossref PubMed Scopus (2846) Google Scholar, 26Abu-Amer Y. Ross F.P. McHugh K.P. Livolsi A. Peyron J.F. Teitelbaum S.L. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29417-29423Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (133) Google Scholar, 27Jimi E. Ikebe T. Takahashi N. Hirata M. Suda T. Koga T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 4605-4608Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (74) Google Scholar). NF-κB, AP-1 and NFATc1 are essential for RANKL-induced osteoclastogenesis (28Grigoriadis A.E. Wang Z.-Q. Cecchini M.G. Hofstetter W. Felix R. Fleisch H.A. Wagner E.F. Science. 1994; 266: 443-448Crossref PubMed Scopus (1061) Google Scholar, 29Takayanagi H. Kim S. Koga T. Nishina H. Isshiki M. Yoshida H. Saiura A. Isobe M. Yokochi T. Inoue J. Wagner E.F. Mak T.W. Kodama T. Taniguchi T. Dev. Cell. 2002; 3: 889-901Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1965) Google Scholar, 30Franzoso G. Carlson L. Xing L. Poljak L. Shores E.W. Brown K.D. Leonardi A. Tran T. Boyce B.F. Siebenlist U. Genes Dev. 1997; 11: 3482-3496Crossref PubMed Scopus (863) Google Scholar, 31Iotsova V. Caamano J. Loy J. Lewin A. Bravo R. Nat. Med. 1997; 3: 1285-1289Crossref PubMed Scopus (877) Google Scholar) and are activated downstream in the RANKL/RANK signaling pathway to induce a variety of responses in osteoclast precursors (29Takayanagi H. Kim S. Koga T. Nishina H. Isshiki M. Yoshida H. Saiura A. Isobe M. Yokochi T. Inoue J. Wagner E.F. Mak T.W. Kodama T. Taniguchi T. Dev. Cell. 2002; 3: 889-901Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1965) Google Scholar, 32Miyazaki T. Katagiri H. Kanegae Y. Takayanagi H. Sawada Y. Yamamoto A. Pando M. Asano T. Verma I. Oda H. Nakamura K. Tanaka S. J. Cell Biol. 2000; 148: 333-342Crossref PubMed Scopus (336) Google Scholar). c-Fos, a component of the dimeric transcription factor, AP-1 (reviewed by Karsenty and Wagner (23Karsenty G. Wagner E.F. Dev. Cell. 2002; 2: 389-406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1190) Google Scholar)), mediates RANKL stimulation of osteoclast formation by transcriptionally inducing NFATc1 (29Takayanagi H. Kim S. Koga T. Nishina H. Isshiki M. Yoshida H. Saiura A. Isobe M. Yokochi T. Inoue J. Wagner E.F. Mak T.W. Kodama T. Taniguchi T. Dev. Cell. 2002; 3: 889-901Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1965) Google Scholar, 33Matsuo K. Galson D.L. Zhao C. Peng L. Laplace C. Wang K.Z. Bachler M.A. Amano H. Aburatani H. Ishikawa H. Wagner E.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 26475-26480Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (465) Google Scholar). NFATc1 is a member of the NFAT transcription factor family of five proteins that regulate the expression of cytokines and immunoregulatory genes in several cell types (34Crabtree G.R. Olson E.N. Cell. 2002; 109: S67-S79Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1087) Google Scholar, 35Rao A. Luo C. Hogan P.G. Annu. Rev. Immunol. 1997; 15: 707-747Crossref PubMed Scopus (2212) Google Scholar, 36Macian F. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5: 472-484Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). NFATc1 rescues osteoclastogenesis in cells lacking c-Fos (29Takayanagi H. Kim S. Koga T. Nishina H. Isshiki M. Yoshida H. Saiura A. Isobe M. Yokochi T. Inoue J. Wagner E.F. Mak T.W. Kodama T. Taniguchi T. Dev. Cell. 2002; 3: 889-901Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1965) Google Scholar, 33Matsuo K. Galson D.L. Zhao C. Peng L. Laplace C. Wang K.Z. Bachler M.A. Amano H. Aburatani H. Ishikawa H. Wagner E.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 26475-26480Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (465) Google Scholar, 37Koga T. Inui M. Inoue K. Kim S. Suematsu A. Kobayashi E. Iwata T. Ohnishi H. Matozaki T. Kodama T. Taniguchi T. Takayanagi H. Takai T. Nature. 2004; 428: 758-763Crossref PubMed Scopus (678) Google Scholar, 38Ishida N. Hayashi K. Hoshijima M. Ogawa T. Koga S. Miyatake Y. Kumegawa M. Kimura T. Takeya T. J. Biol. Chem. 2002; 277: 41147-41156Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (338) Google Scholar, 39Hirotani H. Tuohy N.A. Woo J.T. Stern P.H. Clipstone N.A. J. Biol. Chem. 2004; 279: 13984-13992Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (220) Google Scholar), indicating that c-Fos is upstream of NFATc1. NF-κB comprises a family of five transcription factors, and expression of both p50 and p52 is required for osteoclast formation (30Franzoso G. Carlson L. Xing L. Poljak L. Shores E.W. Brown K.D. Leonardi A. Tran T. Boyce B.F. Siebenlist U. Genes Dev. 1997; 11: 3482-3496Crossref PubMed Scopus (863) Google Scholar, 31Iotsova V. Caamano J. Loy J. Lewin A. Bravo R. Nat. Med. 1997; 3: 1285-1289Crossref PubMed Scopus (877) Google Scholar). NF-κB p50/p52 double knock-out (dKO) mice do not form osteoclasts, whereas osteoclast formation in p50 or p52 single knock-out mice is normal. The dKO mice have increased numbers of CD11b+/RANK+ osteoclast precursors in their spleens (40Xing L. Bushnell T.P. Carlson L. Tai Z. Tondravi M. Siebenlist U. Young F. Boyce B.F. J. Bone Miner. Res. 2002; 17: 1200-1210Crossref PubMed Scopus (134) Google Scholar), indicating that p50/p52 expression is required for progression of these cells along the osteoclast differentiation pathway. The defect cannot be rescued by treatment of dKO splenocytes with RANKL or TNF (40Xing L. Bushnell T.P. Carlson L. Tai Z. Tondravi M. Siebenlist U. Young F. Boyce B.F. J. Bone Miner. Res. 2002; 17: 1200-1210Crossref PubMed Scopus (134) Google Scholar), each of which activates NF-κB in wild-type (WT) osteoclasts (25Kong Y.Y. Yoshida H. Sarosi I. Tan H.L. Timms E. Capparelli C. Morony S. Oliveira-dos-Santos A.J. Van G. Itie A. Khoo W. Wakeham A. Dunstan C.R. Lacey D.L. Mak T.W. Boyle W.J. Penninger J.M. Nature. 1999; 397: 315-323Crossref PubMed Scopus (2846) Google Scholar, 26Abu-Amer Y. Ross F.P. McHugh K.P. Livolsi A. Peyron J.F. Teitelbaum S.L. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29417-29423Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (133) Google Scholar). This is important because TNF can induce osteoclast formation in vitro from WT, RANKL–/–, or RANK–/– osteoclast precursors (41Yamashita T. Xing L. Li P. Schwarz E.M. Dougall W.C. Boyce B.F. J. Bone Miner. Res. 2002; 17: S131Google Scholar, 42Armstrong A.P. Tometsko M.E. Glaccum M. Sutherland C.L. Cosman D. Dougall W.C. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44347-44356Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (195) Google Scholar, 43Kim N. Kadono Y. Takami M. Lee J. Lee S.H. Okada F. Kim J.H. Kobayashi T. Odgren P.R. Nakano H. Yeh W.C. Lee S.K. Lorenzo J.A. Choi Y. J. Exp. Med. 2005; 202: 589-595Crossref PubMed Scopus (301) Google Scholar), indicating that p50 and p52 expression is required for this in vitro effect of TNF. Despite these observations, the mechanism whereby TNF induces osteoclast formation in vitro in the absence of RANKL/RANK signaling remains unknown. Although it is established that RANKL activates c-Fos and NFATc1 in osteoclasts or their precursors (29Takayanagi H. Kim S. Koga T. Nishina H. Isshiki M. Yoshida H. Saiura A. Isobe M. Yokochi T. Inoue J. Wagner E.F. Mak T.W. Kodama T. Taniguchi T. Dev. Cell. 2002; 3: 889-901Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1965) Google Scholar, 33Matsuo K. Galson D.L. Zhao C. Peng L. Laplace C. Wang K.Z. Bachler M.A. Amano H. Aburatani H. Ishikawa H. Wagner E.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 26475-26480Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (465) Google Scholar), there are conflicting data on its effects on NF-κB activation (44Zhu L.L. Zaidi S. Moonga B.S. Troen B.R. Sun L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 326: 131-135Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar). Recent studies have indicated that NF-κB p65 and to a lesser extent p50 proteins are recruited along with NFATc2 to the NFATc1 promoter within 1 h of treatment of osteoclast precursors with RANKL (45Asagiri M. Sato K. Usami T. Ochi S. Nishina H. Yoshida H. Morita I. Wagner E.F. Mak T.W. Serfling E. Takayanagi H. J. Exp. Med. 2005; 202: 1261-1269Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar). c-Fos is not recruited to the NFATc1 promoter until much later (at 24 h), by which time NFATc2 and NF-κB p65 and p50 are no longer detectable. Interestingly, by this time, NFATc1 has been recruited to its own promoter. These investigators suggested that RANKL induces cooperation of NFATc2 pre-existing in precursors with other transcription factors, such as NF-κB to activate initial induction of NFATc1, followed by a later auto-amplification phase of NFATc1 to induce osteoclast formation. Despite these demonstrations of transient NF-κB p65 and p50 association with NFATc2, but not NFATc1, on the NFATc1 promoter, it is still not clear what the relationship is among NF-κB, c-Fos, and NFATc1 during the early events that mediate RANKL or TNF-induced osteoclast formation. This is exemplified by the pathways illustrated in recent review papers of signaling downstream from RANK (46Takayanagi H. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 292-304Crossref PubMed Scopus (1321) Google Scholar, 47Asagiri M. Takayanagi H. Bone. 2007; 40: 251-264Crossref PubMed Scopus (1024) Google Scholar). Thus, it is still not clear whether the essential role of NF-κB p50 and p52 in osteoclast formation is up- or downstream of c-Fos given that expression of both is required for osteoclastogenesis in vitro and in vivo, nor is it clear whether it is necessary for NF-κB p50 and p52 to interact with NFATc1 in osteoclast precursors for their differentiation into osteoclasts. Here, we report that RANKL or TNF can induce osteoclast formation from NF-κB dKO osteoclast precursors when c-Fos is expressed, indicating that NF-κB is upstream of c-Fos. RANKL or TNF treatment and c-Fos expression in dKO cells also induces NFATc1 expression, and retroviral expression of NFATc1 plus treatment with these cytokines rescue the defect in osteoclast formation. These findings indicate that interaction between NFATc1 and NF-κB p50 or p52 is not required for NFATc1 to execute its osteoclastogenic effect. Animals—Generation of NF-κB p50/p52 dKO mice (C57Bl/6 × 129) was described previously (30Franzoso G. Carlson L. Xing L. Poljak L. Shores E.W. Brown K.D. Leonardi A. Tran T. Boyce B.F. Siebenlist U. Genes Dev. 1997; 11: 3482-3496Crossref PubMed Scopus (863) Google Scholar), and mice were used when they were 3–6 weeks old. Littermates of dKO mice that have normal teeth eruption and skeletal development were used as WT controls. The Institutional Animal Care and Use Committee approved all animal studies. Reagents—Recombinant human M-CSF, murine RANKL, interleukin-1β, and TNFα were purchased from R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Polybrene and puromycin were obtained from Sigma. NF-κB activation inhibitor was purchased from Calbiochem. Constructs and Transfection—The coding regions of genes were amplified by PCR from cDNAs and cloned into the pMX-puro retroviral vector (33Matsuo K. Galson D.L. Zhao C. Peng L. Laplace C. Wang K.Z. Bachler M.A. Amano H. Aburatani H. Ishikawa H. Wagner E.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 26475-26480Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (465) Google Scholar, 48Kitamura T. Onishi M. Kinoshita S. Shibuya A. Miyajima A. Nolan G.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 9146-9150Crossref PubMed Scopus (223) Google Scholar). Each 5′ primer contains a Kozak sequence following the start codon. c-Fos was murine, and NF-κB p50 and p52 were of human origin. The pMSCV-caNFATc1 construct was a gift from Dr. N. Clipstone (Northwestern University, Chicago, IL) (49Neal J.W. Clipstone N.A. J. Biol. Chem. 2001; 276: 3666-3673Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar). The pMX-GFP-puro vector was used as a control for infection efficiency. These retrovirus vectors were transiently transfected into the Plat-E retroviral packaging cell line (50Morita S. Kojima T. Kitamura T. Gene Ther. 2000; 7: 1063-1066Crossref PubMed Scopus (1348) Google Scholar), and viral supernatant was collected 48 h later. Osteoclastogenesis and Viral Infection—Splenocytes were extracted from spleens through a fine wire mesh and cultured with conditioned medium from a M-CSF-producing cell line (51Takeshita S. Kaji K. Kudo A. J. Bone Miner. Res. 2000; 15: 1477-1488Crossref PubMed Scopus (478) Google Scholar) (1:20 dilution) for 3 days in α-modified essential medium with 10% fetal calf serum (Hyclone Laboratories, Logan, UT) to enrich for osteoclast precursors, which we named M-CSF-dependent splenocytes (MDS). Then the cells were infected with the retroviral supernatants in the presence of M-CSF (10 ng/ml) and Polybrene (8 μg/ml). On day 2 after infection, puromycin (2 μg/ml) was added to the cultures to select for geneintegrated cells. ∼50–80% of MDS were GFP-positive under fluorescence microscopy 2 days after infection, and this increased to >90% following puromycin treatment. The cells were cultured with M-CSF (10 ng/ml) for 3–7 days. RANKL (10 ng/ml) and TNF (20 ng/ml) (these doses for RANKL and TNF effectively induce osteoclast formation from WT spleen cells) were added every other day. The experiments were stopped during this time based on a visual assessment of multinucleated cell formation using an inverted microscope. Optimal osteoclast formation occurs in WT cell preparations 1–2 days after those from the dKO mice. The cells were fixed, stained for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity to identify osteoclasts as TRAP+ cells containing ≥3 nuclei, and counted, as described previously (52Hughes D.E. Dai A. Tiffee J.C. Li H.H. Mundy G.R. Boyce B.F. Nat. Med. 1996; 2: 1132-1136Crossref PubMed Scopus (696) Google Scholar). For functional studies, infected cells were cultured on bone slices for 10 days under the same conditions as described above. Osteoclasts were then removed, resorption pits were visualized after 0.1% toluidine blue staining, and the mean pit area was measured, as described previously (53Li P. Schwarz E.M. O'Keefe R.J. Ma L. Looney R.J. Ritchlin C.T. Boyce B.F. Xing L. Arthritis Rheum. 2004; 50: 265-276Crossref PubMed Scopus (181) Google Scholar). Quantitative Real-time RT-PCR—RNA from MDS or infected cells was extracted using the RNeasy kit and the QiaShredder from Qiagen (Valencia, CA). cDNA synthesis was performed as described previously (40Xing L. Bushnell T.P. Carlson L. Tai Z. Tondravi M. Siebenlist U. Young F. Boyce B.F. J. Bone Miner. Res. 2002; 17: 1200-1210Crossref PubMed Scopus (134) Google Scholar). Quantitative PCR amplification was performed with gene-specific primers using an iCycler real-time PCR machine using iQ SYBR Green super-mix (both from Bio-Rad Laboratories) according to the manufacturer's instructions. The primer sequences are as follows: NFATc1, forward, 5′-CACATTCTGGTCCATACGA-3′, and reverse, 5′-CGTGTAGCTGCACAATGG-3′; c-fos, forward, 5′-CTGTCAACACACAGGACTTTT-3′, and reverse, 5′-AGGAGATAGCTGCTCTACTTTG-3′; β-actin, forward, 5′-ACCCAGATCATGTTTGAGAC-3′, and reverse, 5′-GTCAGGATCTTCATGAGGTAGT-3′. The relative standard curve method was used to calculate the amplification difference for each primer set (54Johnson M.R. Wang K. Smith J.B. Heslin M.J. Diasio R.B. Anal. Biochem. 2000; 278: 175-184Crossref PubMed Scopus (323) Google Scholar). The standard curve was made from four points corresponding to 10-fold cDNA serial dilution for each gene. For each sample, the relative amount was calculated from its respective standard curve. The quantity of c-fos or NFATc1 mRNA was then obtained by division of each value by the actin value. Standards and samples were run in triplicate. Western Blot Analysis—Infected cells were lysed with radioimmunoprecipitation buffer (50 mm HEPES at pH 7, 1% Triton X-100, 1 mm EDTA, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1% sodium deoxycholate, 150 mm NaCl with protease inhibitors, and sodium orthovanadate). The lysates (20 μg of protein) were resolved by 10% SDS-PAGE and immunoblotted with a rabbit anti-c-Fos, mouse anti-NFATc1 (both from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), or a mouse anti-actin (Sigma) antibody. NFATc1 Nuclear Translocation—c-Fos or GFP virus-infected MDS were cultured with M-CSF and RANKL in 96-well culture plates to generate osteoclasts. After mature osteoclasts were observed, cells were fixed with 10% neutral buffered formalin and permeabilized using 0.1% Triton X-100. Immunofluorescent staining was performed using mouse anti-NFATc1 antibody followed by Cy3-conjugated anti-murine immunoglobulin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Subcellular localization of Cy3-labeled NFATc1 was observed using fluorescence microscopy. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)—To assess c-Fos activation, EMSA was performed as described previously (55Feng J.Q. Xing L. Zhang J.H. Zhao M. Horn D. Chan J. Boyce B.F. Harris S.E. Mundy G.R. Chen D. J. Biol. Chem. 2003; 278: 29130-29135Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar). Briefly, 5 μg of nuclear extracts prepared from untreated MDS or RANKL- or TNF-treated MDS were incubated with 32P-end-labeled 21-mer double-stranded oligonucleotide containing the consensus AP-1 site (5′-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3′) (Santa Cruz Biotechnology) for 30 min at room temperature. The DNA-protein complex formed was then separated from free oligonucleotide on 5% native polyacrylamide gels. Binding specificity was examined by competition with 30-fold excess unlabeled AP-1 oligonucleotide. SP-1 binding sequence 5′-CGAGCCGGCCCCGCCCATC-3′ (Invitrogen) was used as a loading control. Statistics—All experiments were performed more than once with similar results. Results are given as mean ± S.E. Comparisons were made by analysis of variance and Mann-Whitney's U test for unpaired data. p values <0.05 were considered statistically significant. NF-κB Is Upstream from c-Fos in RANKL and TNF-induced Osteoclast Formation—c-Fos, like NF-κB, is activated by RANKL and TNF to induce osteoclast formation (15Takayanagi H. Kim S. Matsuo K. Suzuki H. Suzuki T. Sato K. Yokochi T. Oda H. Nakamura K. Ida N. Wagner E.F. Taniguchi T. Nature. 2002; 416: 744-749Crossref PubMed Scopus (589) Google Scholar), but it is not known whether c-Fos can substitute for NF-κB expression in osteoclast precursors. To examine this question, we overexpressed c-Fos in NF-κB p50/p52 dKO MDS. MDS were used as osteoclast precursors in our study because NF-κB dKO mice have severe osteopetrosis, which prevents harvesting of bone marrow cells. We first examined whether NF-κB p50, p52, and p50+p52 retroviral expression would rescue the defect in osteoclast formation in dKO MDS when the cells were treated with RANKL. Overexpression of p50+p52 in dKO cells rescued osteoclast formation, inducing ∼150 osteoclasts/96 wells (Fig. 1A). In comparison, RANKL-treated GFP-infected WT cells typically formed ∼300 TRAP+ osteoclasts (data not shown), indicating that the maximal rescue efficiency of our system is ∼50% of that of WT cells. c-Fos expression alone, like p50, p52, or p50+p52, did not induce osteoclasts in the absence of RANKL (Fig. 1, A and B). However, when RANKL was added to c-Fos-expressing dKO cells, the combination rescued the osteoclast formation defect, inducing ∼150 osteoclasts (Fig. 1, B and C). The TRAP+ cells that formed on plastic dishes and bone slices from dKO cells overexpressing c-Fos appeared similar to those of WT MDS treated with M-CSF and RANKL, and they formed numerous resorption pits on bone slices, typical of mature WT osteoclasts (Fig. 1D). These data indicate that c-Fos activated by RANKL can efficiently substitute for the lack of p50 and p52 in dKO cells in these culture conditions and that the resulting c-Fos-overexpressing osteoclasts have a bone resorptive capacity similar to that of WT cells. TNF plays important roles in osteoclast formation, activation, and survival in a number of pathologi

Laser-ablation ICP mass-spectroscopy has been used to investigate the geochemistry of sphalerite in a range of nine Zn–Pb deposits in South China. The deposits, which are of different ages and belong to different metallogenic provinces, have been assigned to the following genetic types: skarn (Hetaoping, Luziyuan), syngenetic massive sulphide (Dabaoshan, Laochang and Bainiuchang) and Mississippi-Valley-type (Huize, Mengxing, Niujiaotang) based on the features of the ore, even though their origin is heavily debated based on other criteria. The giant Jinding deposit is considered separately. Sphalerite from each genetic class of deposit shows a distinct chemical signature. Sphalerite from the skarn deposits is characterised by elevated, lattice-bound concentrations of Co and Mn. The distal character of these skarn systems is reflected by the low In content of sphalerite. The three syngenetic massive sulphide deposits feature sphalerite strongly enriched in In, Sn and Ga, whereas the deposits of MVT-type are typically enriched in Ge, Cd, Tl and As. These divergent characters are reflected in absolute element abundances as well as in element ratios. Time-resolved depth profiles for sphalerite from the Chinese deposits confirm the presence of elements such as Co, In, Ge, Ga, and Cd in solid solution, but the dataset expands the understanding of sphalerite mineral chemistry by also indicating that other elements, whose ability to enter the crystal structure of sphalerite has been previously debated (Ag, Sn, Tl, Sb), may also be in solid solution. Sphalerite is a refractory mineral and trace element analysis of sphalerite shows promise as a tracer of ore genesis even in overprinted ores. Systematic work on larger sample suites may help define the geochemical signature of different metallogenic epochs in regions as geologically complex as South China and help resolve the mechanism by which many of the debated ore deposits were formed.

A functional cancer theranostic nanoplatform is developed, specifically tailored toward the optoacoustic modality by combining gold nanorods with DNA nanostructures (D–AuNR). DNA origami is used as an efficient delivery vehicle owing to its prominent tumor-targeting property. The D–AuNR hybrids display an enhanced tumor diagnostic sensitivity by improved optoacoustic imaging and excellent photothermal therapeutic properties in vivo. As a service to our authors and readers, this journal provides supporting information supplied by the authors. Such materials are peer reviewed and may be re-organized for online delivery, but are not copy-edited or typeset. Technical support issues arising from supporting information (other than missing files) should be addressed to the authors. Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article.

Abstract The gut-brain peptide ghrelin and its receptor (GHSR) are established as a regulator of hunger and reward-processing. However, the recently recognized GHSR inverse agonist, liver-expressed antimicrobial peptide 2 (LEAP2), is less characterized. Given the role of GHSR in many central processes, and in particular reward, understanding the central effects of LEAP2 is of high interest to understand reward-related behaviors and disorders, including hedonic feeding in eating disorders. The present study aimed to elucidate LEAP2s central effect on reward-related behaviors through hedonic feeding and its mechanism. LEAP2 was administrated centrally in male mice and effectively reduced hedonic feeding but had no or little effect on homeostatic chow intake when a more palatable option was available. Strikingly, the effect on hedonic feeding was correlated to the preference of the palatable food option, where peanut butter showed the highest preference and the greatest reduction by LEAP2. Further, LEAP2 reduced the rewarding memory of high-preference foods, as well as attenuated the accumbal dopamine release associated with peanut butter exposure and eating. Interestingly, LEAP2 was widely expressed in the brain, and in particular in reward-related brain areas such as the laterodorsal tegmental area (LDTg). The expression in this area was also markedly altered when given free access to peanut butter. Accordingly, infusion of LEAP2 into the LDTg was sufficient to attenuate acute peanut butter eating. Taken together, the present results show that central LEAP2 has a profound effect on central dopaminergic reward signaling and affects several aspects of hedonic eating. The present study highlights LEAP2s effect on reward, which may have application not only for hedonic feeding, but for other reward-related psychiatric disorders as well.

Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) is the main molecular target for coronavirus SARS-CoV-2 to enter cells. Molecularly specific tracers that bind to ACE2 with high affinity can be used to determine the tissue distribution of this important receptor, noninvasively. A novel targeting PET imaging probe, [18F]AlF-DX600-BCH, was developed to detect the in vivo expression of ACE2 and monitor response to therapy. Preclinical experiments, including biodistribution, PET imaging, and tissue section analysis, were conducted after tests of in vitro and in vivo stability and pharmacokinetics. The agent was advanced to clinical evaluation in 10 volunteers who received [18F]AlF-DX600-BCH PET/CT at 1 and 2 h after injection (NCT04542863). Preclinical results of both biodistribution and PET demonstrated [18F]AlF-DX600-BCH accumulation in rat kidney (standardized uptake value; SUVkidney/normal > 50), along with specific uptake in testes (SUVtestis/normal > 10) tissues. Kidney, gastrointestinal, and bronchial cell labeling were correlated to ACE2 positive by immunohistochemistry (IHC) staining. In clinical imaging, significant tracer accumulation was predominantly observed in the urinary and reproductive system (SUVrenal cortex = 32.00, SUVtestis = 4.56), and the conjunctiva and nasal mucosa saw elevated uptake in several cases. This work is the first report of a radioisotope probe, [18F]AlF-DX600-BCH, targeting ACE2 with promising preliminary preclinical and translational outlook, thereby demonstrating the potential of noninvasive mapping of ACE2.

Abstract Emerging COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) poses a great threat to human health and economics. Although SARS-CoV-2 entry mechanism has been explored, little is known about how SARS-CoV-2 regulates the host cell remodeling to facilitate virus invasion process. Here we unveil that SARS-CoV-2 boosts and repurposes filopodia for entry to the target cells. Using SARS-CoV-2 virus-like particle (VLP), real-time live-cell imaging and simulation of active gel model, we reveal that VLP-induced Cdc42 activation leads to the formation of filopodia, which reinforce the viral entry to host cells. By single-particle tracking and sparse deconvolution algorithm, we uncover that VLP particles utilize filopodia to reach the entry site in two patterns, ‘surfing’ and ‘grabbing’, which are more efficient and faster than entry via flat plasma membrane regions. Furthermore, the entry process via filopodia is dependent on the actin cytoskeleton and actin-associated proteins fascin, formin, and Arp2/3. Importantly, either inhibition the actin cross-linking protein fascin or the active level of Cdc42 could significantly hinders both the VLP and the authentic SARS-CoV-2 entry. Together, our results highlight that the spatial-temporal regulation of the actin cytoskeleton by SARS-CoV-2 infection makes filopodia as a ‘highway’ for virus entry, which emerges as an antiviral target. Significance Statement Revealing the mechanism of SARS-CoV-2 invasion is of great significance to explain its high pathogenic and rapid transmission in the world. We discovered a previously unknown route of SARS-CoV-2 entry. SARS-CoV-2 virus-like particles boost cellular filopodia formation by activating Cdc42. Using state-of-art-technology, we spatial-temporally described how virus utilize filopodia to enter the target cell in two modes: ‘surfing’ and ‘grabbing’. Filopodia can directly transport the virus to endocytic hot spots to avoid the virus from disorderly searching on the plasma membrane. Our study complements current knowledge of SARS-CoV-2 that filopodia and its components not only play an important role in virus release and cell-cell transmission, but also in the entry process, and provides several potential therapeutic targets for SARS-CoV-2. Highlights SARS-CoV-2 VLP infection promotes filopodia formation by activating Cdc42 SARS-CoV-2 VLP utilizes filopodia to enter target cell via two modes, ‘surfing’ and ‘grabbing’ Filopodia disruption compromises the invasion of both VLP and authentic SARS-CoV-2

The Ras family genes are proto-oncogenes that are highly conserved from Drosophila to humans. In Drosophila, RasV12 is a constitutively activated form of the Ras oncoprotein, and its function in cell-cycle progression is context dependent. However, how it influences the cell cycle of female germline stem cells (GSCs) still remains unknown. Using both wild-type GSCs and bam mutant GSC-like cells as model systems, here we determined that RasV12 overexpression promotes GSC division, not growth, opposite to that in somatic wing disc cells. Ras performs this function through activating the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling. This signaling is activated specifically in the M phase of mitotic germ cells, including both wild-type GSCs and bam mutant GSC-like cells. Furthermore, RasV12 overexpression triggers polyploid nurse cells to die through inducing mitotic stress. Given the similarities between Drosophila and mammalian GSCs, we propose that the Ras/MAPK signaling also promotes mammalian GSC division.

Abstract During the standardisation process of post-quantum cryptography, NIST encourages research on side-channel analysis for candidate schemes. As the recommended lattice signature scheme, CRYSTALS-Dilithium, when implemented on hardware, has seen limited research on side-channel analysis, and current attacks are incomplete or requires a substantial quantity of traces. Therefore, we conducted a more complete analysis to investigate the leakage of an FPGA implementation of CRYSTALS-Dilithium using the Correlation Power Analysis (CPA) method, where with a minimum of 70,000 traces partial private key coefficients can be recovered. Furthermore, we optimise the attack by extracting Point-of-Interests using known information due to parallelism (named CPA-PoI) and by iteratively utilising parallel leakages (named CPA-ITR). Our experimental results show that CPA-PoI reduces the number of traces by up to 16.67%, CPA-ITR by up to 25%, and both increase the number of recovered key coefficients by up to 55.17% and 93.10% using the same number of traces. They outperfom the CPA method. As a result, it suggests that the FPGA implementation of CRYSTALS-Dilithium is more vulnerable than thought before to side-channel analysis.