Abstract Tumor cell extensions called tumor microtubes (TMs) in glioma resemble neurites during neurodevelopment and connect glioma cells to a network that has considerable relevance for tumor progression and therapy resistance. The determination of interconnectivity in individual tumors has been challenging and the impact of tumor cell connectivity on patient survival remained unresolved so far. Here, a connectivity signature from single-cell RNA-sequenced (scRNA-Seq) xenografted primary glioblastoma (GB) cells was established and clinically validated. Thirty-four of 40 connectivity genes were related to neurogenesis, neural tube development or glioma progression, including the TM-network-relevant GAP43 gene. Astrocytic-like and mesenchymal-like GB cells had the highest connectivity signature scores in scRNA-Seq data of patient-derived xenografts and patient samples. In 230 human GBs, high connectivity correlated with the mesenchymal expression subtype, TP53 wildtype, and with dismal patient survival. CHI3L1 was identified as a robust molecular marker of connectivity. Thus, the connectivity signature allows novel insights into brain tumor biology, provides a proof-of-principle that tumor cell connectivity is relevant for patients’ prognosis, and serves as a robust biomarker that can be used for future clinical trials. Statement of significance Integration of GB cells into functional networks drives tumor progression and resistance. Here, we established and validated a novel connectivity gene expression signature of single GB cells and whole tumors that can be easily applied to clinical and preclinical samples. It is shown that connectivity is determining prognosis combining molecular, functional and clinical insights into the disease.

Background Gliomas are highly invasive brain neoplasms. MRI is the most important tool to diagnose and monitor glioma but has shortcomings. In particular, the assessment of tumor cell invasion is insufficient. This is a clinical dilemma, as recurrence can arise from MRI‐occult glioma cell invasion. Hypothesis Tumor cell invasion, tumor growth and radiotherapy alter the brain parenchymal microstructure and thus are assessable by diffusion tensor imaging (DTI) and MR elastography (MRE). Study Type Experimental, animal model. Animal Model Twenty‐three male NMRI nude mice orthotopically implanted with S24 patient‐derived glioma cells (experimental mice) and 9 NMRI nude mice stereotactically injected with 1 μL PBS (sham‐injected mice). Field Strength/Sequence 2D and 3D T2‐weighted rapid acquisition with refocused echoes (RARE), 2D echo planar imaging (EPI) DTI, 2D multi‐slice multi‐echo (MSME) T2 relaxometry, 3D MSME MRE at 900 Hz acquired at 9.4 T (675 mT/m gradient strength). Assessment Longitudinal 4‐weekly imaging was performed for up to 4 months. Tumor volume was assessed in experimental mice (n = 10 treatment‐control, n = 13 radiotherapy). The radiotherapy subgroup and 5 sham‐injected mice underwent irradiation (3 × 6 Gy) 9 weeks post‐implantation/sham injection. MRI‐/MRE‐parameters were assessed in the corpus callosum and tumor core/injection tract. Imaging data were correlated to light sheet microscopy (LSM) and histology. Statistical Tests Paired and unpaired t ‐tests, a P ‐value ≤0.05 was considered significant. Results From week 4 to 8, a significant callosal stiffening (4.44 ± 0.22 vs. 5.31 ± 0.29 kPa) was detected correlating with LSM‐proven tumor cell invasion. This was occult to all other imaging metrics. Histologically proven tissue destruction in the tumor core led to an increased T2 relaxation time (41.65 ± 0.34 vs. 44.83 ± 0.66 msec) and ADC (610.2 ± 12.27 vs. 711.2 ± 13.42 × 10 −6 mm 2 /s) and a softening (5.51 ± 0.30 vs. 4.24 ± 0.29 kPa) from week 8 to 12. Radiotherapy slowed tumor progression. Data Conclusion MRE is promising for the assessment of key glioma characteristics. Evidence Level NA Technical Efficacy Stage 2

Abstract Purpose This study investigates the biological effect of Tumor Treating Fields (TTFields) on key drivers of glioblastoma’s malignancy—tumor microtube (TM) formation—and on the function and overall integrity of the tumor cell network. Method Using a two-dimensional monoculture GB cell network model (2DTM) of primary glioblastoma cell (GBC) cultures (S24, BG5 or T269), we evaluated the effects of TTFields on cell density, interconnectivity and structural integrity of the tumor network. We also analyzed calcium (Ca 2+ ) transient dynamics and network morphology, validating findings in patient-derived tumoroids and brain tumor organoids. Results In the 2DTM assay, TTFields reduced cell density by 85–88% and disrupted network interconnectivity, particularly in cells with multiple TMs. A “crooked TM” phenotype emerged in 5–6% of treated cells, rarely seen in controls. Ca 2+ transients were significantly compromised, with global Ca 2+ activity reduced by 51–83%, active and periodic cells by over 50%, and intercellular co-activity by 52% in S24, and almost completely in BG5 GBCs. The effects were more pronounced at 200 kHz compared to a 50 kHz TTFields. Similar reductions in Ca 2+ activity were observed in patient-derived tumoroids. In brain tumor organoids, TTFields significantly reduced tumor cell proliferation and infiltration. Conclusion Our comprehensive study provides new insights into the multiple effects of Inovitro-modeled TTFields on glioma progression, morphology and network dynamics in vitro. Future in vivo studies to verify our in vitro findings may provide the basis for a deeper understanding and optimization of TTFields as a therapeutic modality in the treatment of GB.

Abstract Protein kinases control most cellular processes and aberrant kinase activity is involved in numerous diseases. To investigate the link between specific kinase activities and cellular phenotypes in heterogeneous cell populations and in vivo , we introduce molecular recorders of kinase activities for later analysis. Based on split-HaloTag and a phosphorylation-dependent molecular switch, our recorders become rapidly labeled in the presence of a specific kinase activity and a fluorescent HaloTag substrate. The kinase activity in a given cell controls the degree of fluorescent labeling whereas the recording window is set by the presence of the fluorescent substrate. We have designed specific recorders for four protein kinases, including protein kinase A. We apply our protein kinase A recorder for the sorting of heterogeneous cell populations and subsequent transcriptome analysis, in genome-wide CRISPR screens to discover regulators of PKA activity and for the tracking of neuromodulation in freely moving mice.