Insulin resistance occurs in 20%–25% of the human population, and the condition is a chief component of type 2 diabetes mellitus and a risk factor for cardiovascular disease and certain forms of cancer. Herein, we demonstrate that the sphingolipid ceramide is a common molecular intermediate linking several different pathological metabolic stresses (i.e., glucocorticoids and saturated fats, but not unsaturated fats) to the induction of insulin resistance. Moreover, inhibition of ceramide synthesis markedly improves glucose tolerance and prevents the onset of frank diabetes in obese rodents. Collectively, these data have two important implications. First, they indicate that different fatty acids induce insulin resistance by distinct mechanisms discerned by their reliance on sphingolipid synthesis. Second, they identify enzymes required for ceramide synthesis as therapeutic targets for combating insulin resistance caused by nutrient excess or glucocorticoid therapy.

Summary

 Ras is mutated in up to 30% of cancers, including 90% of pancreatic ductal adenocarcinomas, causing it to be constitutively GTP-bound, and leading to activation of downstream effectors that promote a tumorigenic phenotype. As targeting Ras directly is difficult, there is a significant effort to understand the downstream biological processes that underlie its protumorigenic activity. Here, we show that expression of oncogenic Ras or direct activation of the MAPK pathway leads to increased mitochondrial fragmentation and that blocking this phenotype, through knockdown of the mitochondrial fission-mediating GTPase Drp1, inhibits tumor growth. This fission is driven by Erk2-mediated phosphorylation of Drp1 on Serine 616, and both this phosphorylation and mitochondrial fragmentation are increased in human pancreatic cancer. Finally, this phosphorylation is required for Ras-associated mitochondrial fission, and its inhibition is sufficient to block xenograft growth. Collectively, these data suggest mitochondrial fission may be a target for treating MAPK-driven malignancies.

A reduced capacity for mitochondrial fatty acid oxidation in skeletal muscle has been proposed as a major factor leading to the accumulation of intramuscular lipids and their subsequent deleterious effects on insulin action. Here, we examine markers of mitochondrial fatty acid oxidative capacity in rodent models of insulin resistance associated with an oversupply of lipids. C57BL/6J mice were fed a high-fat diet for either 5 or 20 weeks. Several markers of muscle mitochondrial fatty acid oxidative capacity were measured, including 14C-palmitate oxidation, palmitoyl-CoA oxidation in isolated mitochondria, oxidative enzyme activity (citrate synthase, β-hydroxyacyl CoA dehydrogenase, medium-chain acyl-CoA dehydrogenase, and carnitine palmitoyl-transferase 1), and expression of proteins involved in mitochondrial metabolism. Enzyme activity and mitochondrial protein expression were also examined in muscle from other rodent models of insulin resistance. Compared with standard diet–fed controls, muscle from fat-fed mice displayed elevated palmitate oxidation rate (5 weeks +23%, P < 0.05, and 20 weeks +29%, P < 0.05) and increased palmitoyl-CoA oxidation in isolated mitochondria (20 weeks +49%, P < 0.01). Furthermore, oxidative enzyme activity and protein expression of peroxisome proliferator–activated receptor γ coactivator (PGC)-1α, uncoupling protein (UCP) 3, and mitochondrial respiratory chain subunits were significantly elevated in fat-fed animals. A similar pattern was present in muscle of fat-fed rats, obese Zucker rats, and db/db mice, with increases observed for oxidative enzyme activity and expression of PGC-1α, UCP3, and subunits of the mitochondrial respiratory chain. These findings suggest that high lipid availability does not lead to intramuscular lipid accumulation and insulin resistance in rodents by decreasing muscle mitochondrial fatty acid oxidative capacity.

We know a great deal about the cellular response to starvation via AMPK, but less is known about the reaction to nutrient excess. Insulin resistance may be an appropriate response to nutrient excess, but the cellular sensors that link these parameters remain poorly defined. In the present study we provide evidence that mitochondrial superoxide production is a common feature of many different models of insulin resistance in adipocytes, myotubes, and mice. In particular, insulin resistance was rapidly reversible upon exposure to agents that act as mitochondrial uncouplers, ETC inhibitors, or mitochondrial superoxide dismutase (MnSOD) mimetics. Similar effects were observed with overexpression of mitochondrial MnSOD. Furthermore, acute induction of mitochondrial superoxide production using the complex III antagonist antimycin A caused rapid attenuation of insulin action independently of changes in the canonical PI3K/Akt pathway. These results were validated in vivo in that MnSOD transgenic mice were partially protected against HFD induced insulin resistance and MnSOD+/− mice were glucose intolerant on a standard chow diet. These data place mitochondrial superoxide at the nexus between intracellular metabolism and the control of insulin action potentially defining this as a metabolic sensor of energy excess.

Pathological and physiological stimuli, including acute exercise, activate autophagy; however, it is unknown whether exercise training alters basal levels of autophagy and whether autophagy is required for skeletal muscle adaptation to training. We observed greater autophagy flux (i.e., a combination of increased LC3-II/LC3-I ratio and LC3-II levels and reduced p62 protein content indicating a higher rate of initiation and resolution of autophagic events), autophagy protein expression (i.e., Atg6/Beclin1, Atg7, and Atg8/LC3) and mitophagy protein Bnip3 expression in tonic, oxidative muscle compared to muscles of either mixed fiber types or of predominant glycolytic fibers in mice. Long-term voluntary running (4 wk) resulted in increased basal autophagy flux and expression of autophagy proteins and Bnip3 in parallel to mitochondrial biogenesis in plantaris muscle with mixed fiber types. Conversely, exercise training promoted autophagy protein expression with no significant increases of autophagy flux and mitochondrial biogenesis in the oxidative soleus muscle. We also observed increased basal autophagy flux and Bnip3 content without increases in autophagy protein expression in the plantaris muscle of sedentary muscle-specific Pgc-1α. transgenic mice, a genetic model of augmented mitochondrial biogenesis. These findings reveal that endurance exercise training-induced increases in basal autophagy, including mitophagy, only take place if an enhanced oxidative phenotype is achieved. However, autophagy protein expression is mainly dictated by contractile activity independently of enhancements in oxidative phenotype. Exercise-trained mice heterozygous for the critical autophagy protein Atg6 showed attenuated increases of basal autophagy flux, mitochondrial content, and angiogenesis in skeletal muscle, along with impaired improvement of endurance capacity. These results demonstrate that increased basal autophagy is required for endurance exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance.—Lira, V. A., Okutsu, M., Zhang, M., Greene, N. P., Laker, R. C., Breen, D. S., Hoehn, K. L., Yan, Z., Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB J. 27, 4184–4193 (2013). www.fasebj.org

The sphingolipid ceramide negatively regulates insulin action by inhibiting Akt/protein kinase B (PKB), a serine/threonine kinase that is a central regulator of glucose uptake and anabolic metabolism. Despite considerable attention, the molecular mechanism accounting for this action of ceramide has remained both elusive and controversial. Herein we utilized deletion constructs encoding two different functional domains of Akt/PKB to identify which region of the enzyme conferred responsiveness to ceramide. Surprisingly the findings obtained with these separate domains reveal that ceramide blocks insulin stimulation of Akt/PKB by two independent mechanisms. First, using the isolated pleckstrin homology domain, we found that ceramide specifically blocks the translocation of Akt/PKB, but not its upstream activator phosphoinositide-dependent kinase-1, to the plasma membrane. Second, using a construct lacking this pleckstrin homology domain, which does not require translocation for activation, we found that ceramide stimulates the dephosphorylation of Akt/PKB by protein phosphatase 2A. Collectively these findings identify at least two independent mechanisms by which excessive ceramide accumulation in peripheral tissues could contribute to the development of insulin resistance. Moreover the results obtained provide a unifying theory to account for the numerous dissenting reports investigating the actions of ceramide toward Akt/PKB. The sphingolipid ceramide negatively regulates insulin action by inhibiting Akt/protein kinase B (PKB), a serine/threonine kinase that is a central regulator of glucose uptake and anabolic metabolism. Despite considerable attention, the molecular mechanism accounting for this action of ceramide has remained both elusive and controversial. Herein we utilized deletion constructs encoding two different functional domains of Akt/PKB to identify which region of the enzyme conferred responsiveness to ceramide. Surprisingly the findings obtained with these separate domains reveal that ceramide blocks insulin stimulation of Akt/PKB by two independent mechanisms. First, using the isolated pleckstrin homology domain, we found that ceramide specifically blocks the translocation of Akt/PKB, but not its upstream activator phosphoinositide-dependent kinase-1, to the plasma membrane. Second, using a construct lacking this pleckstrin homology domain, which does not require translocation for activation, we found that ceramide stimulates the dephosphorylation of Akt/PKB by protein phosphatase 2A. Collectively these findings identify at least two independent mechanisms by which excessive ceramide accumulation in peripheral tissues could contribute to the development of insulin resistance. Moreover the results obtained provide a unifying theory to account for the numerous dissenting reports investigating the actions of ceramide toward Akt/PKB. A strong correlation between intramyocellular lipid levels and the severity of insulin resistance has prompted investigators to hypothesize that insulin resistance results from the ectopic accumulation of fat in tissues other than adipose (1Schmitz-Peiffer C. Cell. Signal. 2000; 12: 583-594Crossref PubMed Scopus (217) Google Scholar, 2McGarry J.D. Diabetes. 2002; 51: 7-18Crossref PubMed Scopus (1210) Google Scholar). Specifically, many researchers have speculated that increased availability of lipids to peripheral tissues causes insulin resistance by promoting the accumulation of fat-derived metabolites capable of inhibiting insulin action (1Schmitz-Peiffer C. Cell. Signal. 2000; 12: 583-594Crossref PubMed Scopus (217) Google Scholar, 2McGarry J.D. Diabetes. 2002; 51: 7-18Crossref PubMed Scopus (1210) Google Scholar). Numerous recent studies support the hypothesis that the aberrant deposition of the sphingolipid ceramide in skeletal muscle and liver contributes to the development of insulin resistance resulting from lipid oversupply. First, insulin resistant rodents (3Turinsky J. O'Sullivan D.M. Bayly B.P. J. Biol. Chem. 1990; 265: 16880-16885Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 4Kim J.K. Fillmore J.J. Chen Y. Yu C. Moore I.K. Pypaert M. Lutz E.P. Kako Y. Velez-Carrasco W. Goldberg I.J. Breslow J.L. Shulman G.I. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 7522-7527Crossref PubMed Scopus (585) Google Scholar) and humans (5Straczkowski M. Kowalska I. Nikolajuk A. Dzienis-Straczkowska S. Kinalska I. Baranowski M. Zendzian-Piotrowska M. Brzezinska Z. Gorski J. Diabetes. 2004; 53: 1215-1221Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 6Adams II, J.M. Pratipanawatr T. Berria R. Wang E. DeFronzo R.A. Sullards M.C. Mandarino L.J. Diabetes. 2004; 53: 25-31Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar) have elevated ceramide levels in their peripheral tissues. Second, exercise training insulin-resistant rodents markedly improves their insulin sensitivity while substantially lowering intramuscular ceramide levels (7Dobrzyn A. Gorski J. Am. J. Physiol. 2002; 282: E277-E285Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar). Third, ceramide analogs or agents that induce endogenous ceramide accumulation inhibit insulin signaling and insulin-stimulated glycogen synthesis and glucose uptake (8Chavez J.A. Summers S.A. Arch. Biochem. Biophys. 2003; 419: 101-109Crossref PubMed Scopus (383) Google Scholar, 9Chavez J.A. Knotts T.A. Wang L.P. Li G. Dobrowsky R.T. Florant G.L. Summers S.A. J. Biol. Chem. 2003; 278: 10297-10303Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (473) Google Scholar, 10Summers S.A. Garza L.A. Zhou H. Birnbaum M.J. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 5457-5464Crossref PubMed Scopus (362) Google Scholar, 11Kanety H. Hemi R. Papa M.Z. Karasik A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 9895-9897Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (147) Google Scholar, 12Schmitz-Peiffer C. Craig D.L. Bidn T.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 24202-24210Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (494) Google Scholar, 13Teruel T. Hernandez R. Lorenzo M. Diabetes. 2001; 50: 2563-2571Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar, 14Hajduch E. Balendran A. Batty I.H. Litherland G.J. Blair A.S. Downes C.P. Hundal H.S. Diabetologia. 2001; 44: 173-183Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar). Fourth, inhibitors of de novo ceramide synthesis prevent the antagonistic effects of saturated fatty acids on insulin signaling in cultured myotubes (9Chavez J.A. Knotts T.A. Wang L.P. Li G. Dobrowsky R.T. Florant G.L. Summers S.A. J. Biol. Chem. 2003; 278: 10297-10303Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (473) Google Scholar). The inhibitory effect of ceramides on insulin signaling result, at least partially, from their ability to block the phosphorylation and activation of Akt/protein kinase B, a serine/threonine kinase that is a central mediator of many insulin effects (10Summers S.A. Garza L.A. Zhou H. Birnbaum M.J. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 5457-5464Crossref PubMed Scopus (362) Google Scholar, 15Zhou H. Summers S.A. Birnbaum M.J. Pittman R.N. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16568-16575Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (317) Google Scholar, 16Summers S.A. Whiteman E.L. Birnbaum M.J. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2000; 24: S67-S70Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). The studies described herein investigated the molecular mechanism(s) by which ceramide inhibits Akt/PKB 1The abbreviations used are: PKB, protein kinase B; PI, phosphatidylinositol; PDK1, phosphoinositide-dependent kinase-1; PH, pleckstrin homology; GFP, green fluorescent protein; HA, hemagglutinin; PI(3,4,5)P3, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate; PI(3,4)P2, phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate; NBD, 12-(N-methyl-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)); WT, wild type; PP, protein phosphatase; OA, okadaic acid.1The abbreviations used are: PKB, protein kinase B; PI, phosphatidylinositol; PDK1, phosphoinositide-dependent kinase-1; PH, pleckstrin homology; GFP, green fluorescent protein; HA, hemagglutinin; PI(3,4,5)P3, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate; PI(3,4)P2, phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate; NBD, 12-(N-methyl-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)); WT, wild type; PP, protein phosphatase; OA, okadaic acid. activation by insulin. Numerous hormones, growth factors, and transforming oncogenes activate Akt/PKB using a redundant signaling pathway triggered by phosphatidylinositol 3-kinase, a lipid kinase that catalyzes production of 3′-phosphoinositides (i.e. phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI(3,4)P2) and phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PI(3,4,5)P3) (for reviews, see Refs. 16Summers S.A. Whiteman E.L. Birnbaum M.J. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2000; 24: S67-S70Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar and 17Whiteman E.L. Cho H. Birnbaum M.J. Trends Endocrinol. Metab. 2002; 13: 444-451Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (556) Google Scholar). These unique phospholipids serve as docking sites for cytoplasmic proteins with pleckstrin homology (PH) domains, including the serine/threonine kinases Akt/PKB and phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1). 3′-Phosphoinositides displace the PH domain of Akt/PKB, exposing regulatory phosphorylation sites in the catalytic/regulatory domain of the enzyme (e.g. Ser-473 and Thr-308 for the Akt1/PKBα isoform). Moreover, by recruiting both Akt/PKB and PDK1 to common membrane domains, the two enzymes come into closer proximity, facilitating the phosphorylation of the Thr-308 residue by PDK1. 3′-Phosphoinositides, through a second mechanism not involving the recruitment of Akt/PKB to the plasma membrane, promote Ser-473 phosphorylation, which is required for subsequent Thr-308 phosphorylation (18Scheid M.P. Woodgett J.R. FEBS Lett. 2003; 546: 108-112Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar, 19Scheid M.P. Marignani P.A. Woodgett J.R. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 6247-6260Crossref PubMed Scopus (270) Google Scholar). The enzyme responsible for phosphorylating the Ser-473 site has not yet been cloned (20Murata H. Hresko R.C. Mueckler M. J. Biol. Chem. 2003; 278: 21607-21614Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (17) Google Scholar, 21Hresko R.C. Murata H. Mueckler M. J. Biol. Chem. 2003; 278: 21615-21622Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (48) Google Scholar). Ceramide levels in various insulin-resistant rodents and humans are approximately twice those of insulin-sensitive controls (3Turinsky J. O'Sullivan D.M. Bayly B.P. J. Biol. Chem. 1990; 265: 16880-16885Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 4Kim J.K. Fillmore J.J. Chen Y. Yu C. Moore I.K. Pypaert M. Lutz E.P. Kako Y. Velez-Carrasco W. Goldberg I.J. Breslow J.L. Shulman G.I. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 7522-7527Crossref PubMed Scopus (585) Google Scholar). By using a variety of different treatments to modulate intracellular ceramide levels in either C2C12 myotubes or 3T3-L1 preadipocytes, we have shown that artificially increasing intracellular ceramide 2-fold over basal values blocks activation of Akt/PKB by insulin (8Chavez J.A. Summers S.A. Arch. Biochem. Biophys. 2003; 419: 101-109Crossref PubMed Scopus (383) Google Scholar, 9Chavez J.A. Knotts T.A. Wang L.P. Li G. Dobrowsky R.T. Florant G.L. Summers S.A. J. Biol. Chem. 2003; 278: 10297-10303Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (473) Google Scholar, 22Stratford S. DeWald D.B. Summers S.A. Biochem. J. 2001; 354: 359-368Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar). Short-chain ceramide analogs recapitulate the effect of inducing endogenous ceramide accumulation (9Chavez J.A. Knotts T.A. Wang L.P. Li G. Dobrowsky R.T. Florant G.L. Summers S.A. J. Biol. Chem. 2003; 278: 10297-10303Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (473) Google Scholar, 10Summers S.A. Garza L.A. Zhou H. Birnbaum M.J. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 5457-5464Crossref PubMed Scopus (362) Google Scholar, 22Stratford S. DeWald D.B. Summers S.A. Biochem. J. 2001; 354: 359-368Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar). Interestingly in our prior studies we have detected no effects of either induced endogenous ceramide or short-chain ceramide analogs on upstream signaling events, such as the phosphorylation of insulin receptor substrate proteins or the activation of PI 3-kinase (8Chavez J.A. Summers S.A. Arch. Biochem. Biophys. 2003; 419: 101-109Crossref PubMed Scopus (383) Google Scholar, 10Summers S.A. Garza L.A. Zhou H. Birnbaum M.J. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 5457-5464Crossref PubMed Scopus (362) Google Scholar, 22Stratford S. DeWald D.B. Summers S.A. Biochem. J. 2001; 354: 359-368Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar). In this study, we sought to understand the mechanisms underlying the inhibitory effect of ceramide by defining the region of Akt/PKB that confers responsiveness to ceramide. Specifically we evaluated effects of ceramide analogs on truncated constructs encoding either (a) the isolated PH domain, which translocates to the plasma membrane following insulin treatment, or (b) the isolated catalytic/regulatory domain, which is phosphorylated and activated in response to insulin via a translocation-independent mechanism. Surprisingly the findings obtained revealed the existence of two independent mechanisms by which ceramide regulates Akt/PKB, each initiated downstream of PI 3-kinase and culminating on a separate domain of Akt/PKB. Antibodies and Reagents—Polyclonal antibodies directed against the phosphorylated forms of mitogen-activated protein kinase and Akt/PKB (Ser-473 site) were from Promega (Madison, WI) and Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA), respectively, and those against hemagglutinin were from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Secondary anti-rabbit antibodies coupled to Texas Red or horseradish peroxidase were from Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA) or Santa Cruz Biotechnology, Inc., respectively. C2-ceramide and C2-dihydroceramide were from Calbiochem-Novabiochem. Porcine insulin was from Sigma. PI(3,4,5)P3 was from Echelon Biosciences (Salt Lake City, UT). Cell Culture—3T3-L1 preadipocytes were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% calf serum. Preadipocytes expressing the Akt/PKB constructs were periodically selected in 800 μg/ml G418 and were described previously (23Summers S.A. Whiteman E.L. Cho H. Lipfert L. Birnbaum M.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 23858-23867Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (55) Google Scholar). Cell Lines and cDNA Constructs—3T3-L1 preadipocytes stably expressing HA-tagged human Akt1/PKBα (HA-Akt/PKB) or Δ4–129-Akt/PKB (Cat/Reg-Akt/PKB) were provided by Richard Roth (Stanford University, Stanford, CA) and were described previously (24Kohn A.D. Kovacina K.S. Roth R.A. EMBO J. 1995; 14: 4288-4295Crossref PubMed Scopus (318) Google Scholar). Sandra Watton and Doreen Cantrell (Imperial Cancer Research Fund, London, UK) provided the PH domain of Akt/PKB coupled to green fluorescent protein (GFP) (25Watton S.J. Downward J. Curr. Biol. 1999; 9: 433-436Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (262) Google Scholar). HA-tagged PDK1 was described previously (26Wick M.J. Dong L.Q. Riojas R.A. Ramos F.J. Liu F. J. Biol. Chem. 2000; 275: 40400-40406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar). The GFP-tagged catalytic domain of Akt/PKB (amino acids 126–480) was generated by PCR using a forward primer (GGGAGATCTAGTGACAACTCAGGGGCTGAAG), which inserted a BglII restriction site, and a reverse primer 3′ primer (GGGGAATTCTCAGGCTGTCGGACTGGC), which inserted an EcoRI restriction site after the stop codon. The PCR fragment was obtained using full-length GFP-Akt as a template, and the PCR product obtained was cloned into the pGEM TA cloning vector (Promega), digested with BglII and EcoRI, and subcloned into the pEGFP vector (Clontech). Analysis of Akt/PKB Translocation by Confocal Microscopy—3T3-L1 preadipocytes at 20–30% confluency on coverslips were transfected with 10 μg of cDNA encoding GFP-Akt-PH, GFP-Cat/Reg-Akt/PKB, or HA-PDK1 using the LipoTAXI mammalian transfection kit (Stratagene, La Jolla, CA). Cells were analyzed by confocal fluorescence microscopy 48 h post-transfection. Digital image processing was performed as described previously using Metamorph software (22Stratford S. DeWald D.B. Summers S.A. Biochem. J. 2001; 354: 359-368Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar). GFP-tagged proteins were visualized directly, while HA-tagged ones were visualized by immunofluorescence with anti-HA antibodies using methods described previously (27Summers S.A. Kao A.W. Kohn A.D. Backus G.S. Roth R.A. Pessin J.E. Birnbaum M.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17934-17940Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (195) Google Scholar). PI 3-Kinase Assays—PI 3-kinase assays were performed using the method of Wang and Summers (28Wang L.P. Summers S.A. Methods Mol. Med. 2003; 83: 127-136PubMed Google Scholar). Delivery of PI(3,4,5)P3—PI(3,4,5)P3 was delivered using the Shuttle PIP™ kit from Echelon Biosciences. Briefly 3T3-L1 preadipocytes were grown to confluency and serum-starved in Dulbecco's modified Eagle's medium + 0.2% bovine serum albumin for 2 h prior to treatment. Equimolar concentrations of PI(3,4,5)P3 and histone carrier were mixed, sonicated, and incubated at room temperature for 10 min. The mixture was added to cells at a final concentration of 1 μm for 10 min prior to lysis. For selected assays, NBD-labeled PI(3,4,5)P3 was included and visualized by fluorescence microscopy. Immunoblot Analyses of Total Cell Lysates—Cells grown to confluency in 100-mm-diameter dishes were serum-deprived as indicated in the figure legends. Cells were washed twice with ice-cold phosphate-buffered saline and lysed in 100 μl of 66 mm Tris (pH 8.0) containing 2% SDS and 100 mm vanadate. Samples were boiled for 2 min, and DNA was sheared by passing extracts through a 27-gauge needle several times. Insoluble material was pelleted by centrifuging the samples for 30 min at 20,000 × g. Protein concentrations were determined using the bicinchoninic protein assay kit from Pierce, and 40 μg of total protein were loaded into each well of a 7.5% or 10% polyacrylamide gel. Proteins were transferred to nitrocellulose and probed with the indicated antibodies as described previously (29Summers S.A. Lipfert L. Birnbaum Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998; 246: 76-81Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Antibody detection was performed using the enhanced chemiluminescence kit from Amersham Biosciences. PDK1 Kinase Assay—3T3-L1 preadipocytes were grown to 50% confluency and transfected with pBEX-PDK1 using calcium phosphate. Cells were serum-deprived in Dulbecco's modified Eagle's medium and 0.2% bovine serum albumin for 2 h and treated with or without insulin and/or C2-ceramide. Cells were lysed in 1 ml of lysis buffer (150 mm NaCl, 25 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, 0.2 mm EGTA, 5 mm MgCl2, 1 mm dithiothreitol, 10% glycerol, 2% Igepal, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 IU/ml aprotinin, 2 μg/ml leupeptin), incubated on ice for 15 min, and then centrifuged for 10 min. The supernatant (900 μl) was transferred to new tubes and rocked with 8 μl of rabbit anti-HA antibodies for 1 h at 4 °C. Thirty microliters of Protein A-agarose beads were washed in lysis buffer, centrifuged, and incubated with the supernatant for 1 h at 4 °C. Samples were then washed three times with lysis buffer, twice more with kinase buffer (50 mm Hepes, 10 mm MgCl2, 2 mm MnCl2, 0.2 mm dithiothreitol), and resuspended in kinase buffer. Sphingosine (1 mm) and C2-ceramide (1 mm) were prepared as stock solutions in kinase buffer containing 4 mg/ml bovine serum albumin and were added at a final concentration of 100 μm.[32P]ATP (5 μCi) was added to each sample in 200 μm ATP + Mg2+. The final volume for the reaction was 50 μl. Samples were incubated at 30 °C for 30 min, and the reaction was stopped by the addition of 50 μl of sample buffer. Proteins were resolved by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and visualized on a Storm PhosphorImager. Ceramide Blocks the Effects of Insulin on Both the PH Domain and the Catalytic/Regulatory Domain of Akt/PKB—Akt/PKB is comprised of an amino-terminal pleckstrin homology domain followed by a carboxyl-terminal catalytic/regulatory domain (31Datta K. Franke T.F. Chan T.O. Makris A. Yang S.I. Kaplan D.R. Morrison D.K. Golemis E.A. Tsichlis P.N. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 2304-2310Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar). As described earlier, Akt/PKB translocates to the plasma membrane in insulin-stimulated cells because of high affinity interactions between its PH domain and insulin-generated 3′-phosphoinositides (32Kavran J.M. Klein D.E. Lee A. Falasca M. Isakoff S.J. Skolnik E.Y. Lemmon M.A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30497-30508Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (377) Google Scholar). The 3′-phosphoinositides displace the PH domain of Akt/PKB, exposing two regulatory phosphorylation sites within the catalytic/regulatory domain (17Whiteman E.L. Cho H. Birnbaum M.J. Trends Endocrinol. Metab. 2002; 13: 444-451Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (556) Google Scholar). To determine whether ceramide blocked the insulin-stimulated recruitment of Akt/PKB to the plasma membrane, we assessed the effects of a short-chain ceramide analog (C2-ceramide) on the subcellular distribution of Akt/PKB constructs tagged with GFP. Within minutes, insulin stimulated the translocation of either a full-length Akt/PKB construct (wild type, WT-Akt/PKB) or a truncated one encoding only the PH domain (PH-Akt/PKB). Pretreating with C2-ceramide completely blocked this insulin-stimulated movement of either construct (Fig. 1). Removal of the PH domain (Cat/Reg-Akt/PKB) rendered Akt/PKB incapable of translocating to the plasma membrane, and its subcellular distribution was unaltered by C2-ceramide (Fig. 1). Interestingly Roth and colleagues (33Kohn A.D. Takeuchi F. Roth R.A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 21920-21926Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (407) Google Scholar) have demonstrated previously that, through a PI 3-kinase-dependent mechanism, insulin activates Cat/Reg-Akt/PKB by stimulating its phosphorylation on two sites. Presumably removal of the PH domain eliminates the need for membrane localization as the domain no longer blocks accessibility to the regulatory residues. However, activation of the enzyme still requires PI 3-kinase as Ser-473 phosphorylation occurs through a separable PI 3-kinase-dependent pathway (18Scheid M.P. Woodgett J.R. FEBS Lett. 2003; 546: 108-112Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar, 19Scheid M.P. Marignani P.A. Woodgett J.R. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 6247-6260Crossref PubMed Scopus (270) Google Scholar). Reasoning that this construct would be insensitive to the inhibitory effects of ceramide, we determined whether C2-ceramide blocked the phosphorylation and activation of Cat/Reg-Akt/PKB. Surprisingly C2-ceramide completely inhibited the insulin-stimulated phosphorylation and activation of Cat/Reg-Akt/PKB (Fig. 2). Specifically we were able to simultaneously assess the phosphorylation state of both endogenous Akt/PKB and Cat/Reg-Akt/PKB in 3T3-L1 preadipocytes stably expressing the deletion construct. Using antibodies that recognize the Ser-473 phosphorylation site, we found that C2-ceramide blocks phosphorylation of both endogenous Akt/PKB and Cat/Reg-Akt/PKB comparably (Fig. 2A). We additionally measured the kinase activity of the immunoisolated Cat/Reg-Akt/PKB construct and found that ceramide completely ablated the insulin-stimulated increase in enzymatic activity (Fig. 2B). Ceramide Does Not Inhibit Upstream Signaling Events—The observation that ceramide inhibits distinct domains on Akt/PKB suggested that the effects of sphingolipid were the result of an inhibition of upstream signaling events. Moreover researchers have used labeled PH domains as a means of measuring 3-phosphoinositide generation in vivo (34Whiteman E.L. Chen J.J. Birnbaum M.J. Endocrinology. 2003; 144: 3811-3820Crossref PubMed Scopus (40) Google Scholar, 35Gray A. Van Der Kaay J. Downes C.P. Biochem. J. 1999; 344: 929-936Crossref PubMed Scopus (181) Google Scholar), suggesting that C2-ceramide was probably blocking the activation of PI 3-kinase or the accumulation of PI(3,4)P2 or PI(3,4,5)P3. Although others and we have demonstrated that C2-ceramide has no effect on PI 3-kinase in NIH-3T3 fibroblasts or 3T3-L1 adipocytes (9Chavez J.A. Knotts T.A. Wang L.P. Li G. Dobrowsky R.T. Florant G.L. Summers S.A. J. Biol. Chem. 2003; 278: 10297-10303Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (473) Google Scholar, 10Summers S.A. Garza L.A. Zhou H. Birnbaum M.J. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 5457-5464Crossref PubMed Scopus (362) Google Scholar, 13Teruel T. Hernandez R. Lorenzo M. Diabetes. 2001; 50: 2563-2571Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar, 15Zhou H. Summers S.A. Birnbaum M.J. Pittman R.N. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16568-16575Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (317) Google Scholar, 22Stratford S. DeWald D.B. Summers S.A. Biochem. J. 2001; 354: 359-368Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar, 36Zinda M.J. Vlahos C.J. Lai M.T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 280: 1107-1115Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 37Bourbon N.A. Sandirasegarane L. Kester M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 3286-3292Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (207) Google Scholar, 38Salinas M. Lopez-Valdaliso R. Martin D. Alvarez A. Cuadrado A. Mol. Cell. Neurosci. 2000; 15: 156-169Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar, 39Schubert K.M. Scheid M.P. Duronio V. J. Biol. Chem. 2000; 275: 13330-13335Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar), contradicting reports have suggested that C2-ceramide potently inhibits PI 3-kinase activation (11Kanety H. Hemi R. Papa M.Z. Karasik A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 9895-9897Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (147) Google Scholar, 40Zundel W. Giaccia A. Genes Dev. 1998; 12: 1941-1946Crossref PubMed Scopus (200) Google Scholar, 41Peraldi P. Hotamisligil G.S. Buurman W.A. White M.F. Spiegelman B.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 13018-13022Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (361) Google Scholar). To confirm that the effects of C2-ceramide did not result from its inhibition of PI 3-kinase we evaluated whether C2-ceramide blocked activation of Akt/PKB triggered by directly introducing PI(3,4,5)P3 into intracellular domains. Specifically, Shuttle PIP carriers (Echelon Biosciences) were used to deliver PI(3,4,5)P3 into living 3T3-L1 preadipocytes. Fig. 3A demonstrates the subcellular localization of NBD-labeled PI(3,4,5)P3, which did not appear in either the nucleus or plasma membrane but instead localized to large structures present throughout the interior of the cell (Fig. 3A). At concentrations as low as 1 μm, PI(3,4,5)P3 stimulated the phosphorylation of Akt/PKB (Fig. 3B). Interestingly PI(3,4,5)P3 also stimulated the phosphorylation of Cat/Reg-Akt/PKB, confirming the existence of a PI 3-kinase-dependent pathway responsible for Akt/PKB phosphorylation that is independent of the effect on Akt/PKB translocation (42Scheid M.P. Lauener R.W. Duronio V. Biochem. J. 1995; 312: 159-162Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). C2-ceramide completely blocked Akt/PKB phosphorylation induced by PI(3,4,5)P3, confirming that C2-ceramide regulates Akt/PKB independently of effects on PI 3-kinase. An alternative possibility was that C2-ceramide was promoting 3′-phosphoinositide degradation or altering the ability of 3′-phosphoinositide to effectively signal to all of its target molecules. To confirm that 3′-phosphoinositides were capable of signaling to downstream effectors other than Akt/PKB, we determined whether C2-ceramide altered the translocation of another target of 3′-phosphoinositides, PDK1. To effectively remove PDK1 from the plasma membrane, we treated cells with the PI 3-kinase inhibitor LY294002 ∼16 h before performing the experiment. This treatment effected a redistribution of GFP-tagged PDK1 from the plasma membrane to the cytoplasm. The addition of insulin rapidly stimulated the translocation of PDK1 to the plasma membrane (Fig. 4) via a PI 3-kinase-dependent mechanism (data not shown). C2-ceramide, under conditions that completely blocked Akt/PKB phosphorylation, activation, and translocation, had no effect on the movement of PDK1 (Fig. 4). These data indicate that PI(3,4,5)P3 is produced and functional in these cells, but it is incapable of recruiting and activating Akt/PKB in cells loaded with excess ceramide. Surprisingly Filippa et al. (43Filippa N. Sable C.L. Hemmings B.A. Van Obberghen E. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 5712-5721Crossref PubMed Scopus (112) Google Scholar) reported that the catalytic/regulatory domain of Akt/PKB can interact directly with PDK1, thus negating the need for 3′-phosphoinositides in its translocation. In this prior study, catalytically inactive forms of PDK1, as well as those lacking their PH domains, were incapable of promoting Akt/PKB translocation. Although we were unable to detect any movement of Cat/Reg-Akt to the plasma membrane (Fig. 1), we nonetheless evaluated the effects of ceramide on PDK1 kinase activity as the inhibition of PDK1 activity could account for the effects on Cat/Reg-Akt phosphorylation and activation. C2-ceramide, at concentrations as high as 100 μm, had no effect on the activity of immunoisolated PDK1 (Fig. 4B). Interestingly King et al. (44King C.C. Zenke F.T. Dawson P.E. Dutil E.M. Newton A.C. Hemmings B.A. Bokoch G.M. J. Biol. Chem. 2000; 275: 18108-18113Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar) found that sphingosine dramatically stimulates PDK1 activity and have hypothesized that this is important for PDK1 activation by hormonal stimuli. Since C2-ceramide contains a sphingosine backbone, we hypothesized that C2-ceramide might block the sphingosine-induced increase in PDK1 activity. However, although sphingosine potently activated

Mitochondrial division is essential for mitosis and metazoan development, but a mechanistic role in cancer biology remains unknown. Here, we examine the direct effects of oncogenic RAS(G12V)-mediated cellular transformation on the mitochondrial dynamics machinery and observe a positive selection for dynamin-related protein 1 (DRP1), a protein required for mitochondrial network division. Loss of DRP1 prevents RAS(G12V)-induced mitochondrial dysfunction and renders cells resistant to transformation. Conversely, in human tumor cell lines with activating MAPK mutations, inhibition of these signals leads to robust mitochondrial network reprogramming initiated by DRP1 loss resulting in mitochondrial hyper-fusion and increased mitochondrial metabolism. These phenotypes are mechanistically linked by ERK1/2 phosphorylation of DRP1 serine 616; DRP1(S616) phosphorylation is sufficient to phenocopy transformation-induced mitochondrial dysfunction, and DRP1(S616) phosphorylation status dichotomizes BRAF(WT) from BRAF(V600E)-positive lesions. These findings implicate mitochondrial division and DRP1 as crucial regulators of transformation with leverage in chemotherapeutic success.

Mitochondrial dysfunction plays important roles in many diseases, but there is no satisfactory method to assess mitochondrial health in vivo. Here, we engineered a MitoTimer reporter gene from the existing Timer reporter gene. MitoTimer encodes a mitochondria-targeted green fluorescent protein when newly synthesized, which shifts irreversibly to red fluorescence when oxidized. Confocal microscopy confirmed targeting of the MitoTimer protein to mitochondria in cultured cells, Caenorhabditis elegans touch receptor neurons, Drosophila melanogaster heart and indirect flight muscle, and mouse skeletal muscle. A ratiometric algorithm revealed that conditions that cause mitochondrial stress led to a significant shift toward red fluorescence as well as accumulation of pure red fluorescent puncta of damaged mitochondria targeted for mitophagy. Long term voluntary exercise resulted in a significant fluorescence shift toward green, in mice and D. melanogaster, as well as significantly improved structure and increased content in mouse FDB muscle. In contrast, high-fat feeding in mice resulted in a significant shift toward red fluorescence and accumulation of pure red puncta in skeletal muscle, which were completely ameliorated by voluntary wheel running. Hence, MitoTimer allows for robust analysis of multiple parameters of mitochondrial health under both physiological and pathological conditions and will be highly useful for future research of mitochondrial health in multiple disciplines in vivo.

Dysregulation of oxidative phosphorylation is associated with increased mitochondrial reactive oxygen species production and some of the most prevalent human diseases including obesity, cancer, diabetes, neurodegeneration, and heart disease. Chemical 'mitochondrial uncouplers' are lipophilic weak acids that transport protons into the mitochondrial matrix via a pathway that is independent of ATP synthase, thereby uncoupling nutrient oxidation from ATP production. Mitochondrial uncouplers also lessen the proton motive force across the mitochondrial inner membrane and thereby increase the rate of mitochondrial respiration while decreasing production of reactive oxygen species. Thus, mitochondrial uncouplers are valuable chemical tools that enable the measurement of maximal mitochondrial respiration and they have been used therapeutically to decrease mitochondrial reactive oxygen species production. However, the most widely used protonophore uncouplers such as carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) and 2,4-dinitrophenol have off-target activity at other membranes that lead to a range of undesired effects including plasma membrane depolarization, mitochondrial inhibition, and cytotoxicity. These unwanted properties interfere with the measurement of mitochondrial function and result in a narrow therapeutic index that limits their usefulness in the clinic. To identify new mitochondrial uncouplers that lack off-target activity at the plasma membrane we screened a small molecule chemical library. Herein we report the identification and validation of a novel mitochondrial protonophore uncoupler (2-fluorophenyl){6-[(2-fluorophenyl)amino](1,2,5-oxadiazolo[3,4-e]pyrazin-5-yl)}amine, named BAM15, that does not depolarize the plasma membrane. Compared to FCCP, an uncoupler of equal potency, BAM15 treatment of cultured cells stimulates a higher maximum rate of mitochondrial respiration and is less cytotoxic. Furthermore, BAM15 is bioactive in vivo and dose-dependently protects mice from acute renal ischemic-reperfusion injury. From a technical standpoint, BAM15 represents an effective new tool that allows the study of mitochondrial function in the absence of off-target effects that can confound data interpretation. From a therapeutic perspective, BAM15-mediated protection from ischemia-reperfusion injury and its reduced toxicity will hopefully reignite interest in pharmacological uncoupling for the treatment of the myriad of diseases that are associated with altered mitochondrial function.