The 5′-cap structure is a distinct feature of eukaryotic mRNAs, and eukaryotic viruses generally modify the 5′-end of viral RNAs to mimic cellular mRNA structure, which is important for RNA stability, protein translation and viral immune escape. SARS coronavirus (SARS-CoV) encodes two S-adenosyl-L-methionine (SAM)-dependent methyltransferases (MTase) which sequentially methylate the RNA cap at guanosine-N7 and ribose 2′-O positions, catalyzed by nsp14 N7-MTase and nsp16 2′-O-MTase, respectively. A unique feature for SARS-CoV is that nsp16 requires non-structural protein nsp10 as a stimulatory factor to execute its MTase activity. Here we report the biochemical characterization of SARS-CoV 2′-O-MTase and the crystal structure of nsp16/nsp10 complex bound with methyl donor SAM. We found that SARS-CoV nsp16 MTase methylated m7GpppA-RNA but not m7GpppG-RNA, which is in contrast with nsp14 MTase that functions in a sequence-independent manner. We demonstrated that nsp10 is required for nsp16 to bind both m7GpppA-RNA substrate and SAM cofactor. Structural analysis revealed that nsp16 possesses the canonical scaffold of MTase and associates with nsp10 at 1∶1 ratio. The structure of the nsp16/nsp10 interaction interface shows that nsp10 may stabilize the SAM-binding pocket and extend the substrate RNA-binding groove of nsp16, consistent with the findings in biochemical assays. These results suggest that nsp16/nsp10 interface may represent a better drug target than the viral MTase active site for developing highly specific anti-coronavirus drugs.

Summary Pathogenic protists of the genus Leishmania have evolved various strategies to exploit macrophages as host cells and subvert their immuno-metabolic functions to favour intracellular parasite survival. Surprisingly little is known on how Leishmania affects regulated cell death (RCD) pathways of its host cell, even though increased survival of in vitro infected macrophages has been reported, and chronic macrophage infection in vivo causes the devastating immunopathologies of leishmaniasis. To overcome this limitation and gain first systems-level insight into the interaction between intracellular Leishmania and the host cell RCD pathways, including apoptosis, pyroptosis and necroptosis, we applied transcriptomic analyses on L. amazonensis -infected, primary macrophages (termed LIMs) and used YO-PRO-1 to monitor cell death by fluorescent microscopy. RNAseq analyses at day 3 post-infection (PI) revealed dichotomic dysregulation of more than 60% of RCD-related genes in LIMs, characterized by up-regulation of anti-RCD and down-regulation of pro-RCD markers, including key regulators common to the three forms of cell death such as casp8, fadd, tradd, tnfaip3, tax1bp1, birc3 , and itch . This profile correlated with expression changes of transcription factors known to regulate RCD, including AP1 and NF-κB family members, pparγ and cebpβ . Consequently, LIMs showed remarkable longevity in culture for at least 50 days, despite a constant increase of parasite burden to about 100 parasites per cell, while non-infected cells were cleared from the culture in just a few days. Longitudinal expression analysis of LIMs at days 0, 3, 15, and 30 PI by RT-qPCR confirmed stable maintenance of this high longevity profile with the dichotomic decrease and increase of RCD-activators and -inhibitors, respectively. LIMs further showed significant resistance to RCD-inducing signals compared to non-infected cells, including CSF-1 deprivation (intrinsic apoptosis), actinomycin D treatment (extrinsic apoptosis), LPS/ATP stimulation (pyroptosis). Significantly, we extended the anti-RCD expression pattern and RCD resistance phenotype to L. amazonensis -infected macrophages recovered from lesions, thus validating our long-term in vitro infection system as an easily accessible model to study chronic macrophage infection. In conclusion, our analyses firmly document the pan-anti RCD effect of L. amazonensis on its macrophage host cell in vitro and in vivo and shed important new light on mechanisms underlying Leishmania chronic infection.

ABSTRACT Macrophages are the major host cells of the protozoan parasite Leishmania in mammalian infection. These key innate immune cells display remarkable phenotypic plasticity ranging from pro-inflammatory M1 to anti-inflammatory M2 macrophages that can control infection and tissue homeostasis, respectively. It has been recognized that Leishmania exploits macrophage phenotypic plasticity to establish chronic infection. However, the current notion that these parasites simply trigger an M2-like phenotype seems over-simplified considering the immunopathology observed during leishmaniasis – in particular in response to Leishmania amazonensis - which is often characterized by a mixed Th1/Th2 immune response. Here we combined a series of systems-level analyses to shed new light on the phenotype of Leishmania -infected macrophages (LIMs) during short- and long-term infection, in vitro and in vivo . Immuno-metabolic profiling by RNA-seq, RT-qPCR, cytokine immunoassays, and real-time bioenergetic flux analysis of L. amazonensis -infected bone marrow-derived macrophages (BMDMs) revealed a highly complex and unique phenotypic and bioenergetic signature. In vitro LIMs were characterized by co-expression of both M1 and M2 markers at RNA and protein levels and increased expression of glycolytic genes that matched a progressive metabolic switch from a M2-like respiratory to a M1-like glycolytic energy production observed for both long-term in vitro and in vivo infected macrophages. Unlike in M1 macrophages, glycolytic gene expression did not correlate with increased expression of its key regulatory HIF-1α. In contrast, siRNA knock down experiments in primary BMDMs uncovered an essential role of the m 6 A reader protein IGF2BP2 in stabilizing m 6 A modified transcripts of the glycolytic pathway, contributing to HIF-1α-independent induction of glycolysis. In conclusion, L. amazonensis establishes a complex and unique phenotypic shift in infected macrophages in vitro and in vivo that combines M1-like and M2-like immuno-metabolomic characteristics and implicates differential mRNA stability in induction of aerobic glycolysis. Our data thus uncover epi-transcriptomic regulation as a novel target for Leishmania immune subversion to establish a host cell phenotype beneficial for intracellular parasite development and chronic infection.

Colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related mortality, and CRC detection through screening improves survival rates. A promising avenue to improve patient screening compliance is the development of minimally-invasive liquid biopsy assays that target CRC biomarkers on circulating cell-free DNA (cfDNA) in peripheral plasma. In this report, we identify cfDNA biomarker candidate genes bearing the epigenetic mark 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) that diagnose occult CRC up to 36 months prior to clinical diagnosis using the Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian (PLCO) Cancer Screening Trial samples.

Detection of colorectal carcinomas at a time when there are more treatment options is associated with better outcomes. This prospective case-control study assessed the 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) biomarkers in circulating cell-free DNA (cfDNA) for early detection of colorectal carcinoma and advanced adenomas (AA).

Abstract Understanding the community structure and functional capacity of the lower respiratory tract microbiome is crucial for elucidating its roles in respiratory tract diseases. However, there are few studies about it owing to the difficulty in obtaining microbial samples from the lower respiratory tract. Here we collected 745 microbial samples from the porcine lower respiratory tract by harvesting 675 pigs, and constructed a gene catalog containing 10,337,194 nonredundant genes, of which only 30% could be annotated taxonomically. We obtained 397 metagenome-assembled genomes (MAGs) including 111 MAGs with high-quality. These 397 MAGs were further clustered into 292 species-level genome bins (SGBs), among which 56% SGBs are unknown with current databases. Combining with the lung lesion phenotype, we found that Mycoplasma hyopneumoniae strains and the adhesion-related virulence factors harboring in their genomes were significantly associated with porcine lung lesions, implying the role of adhesion and overgrowth of pathogenic M. hyopneumoniae in host lung diseases. This study provided important resources for the study of porcine lower respiratory tract microbiome and lung health.

OBJECTIVES: Robust biomarkers for pancreatic cancer (PaC) early detection/prognosis are critical for improved patient survival. Our goal was to explore the biomarker potential of 5-hydroxymethylcytosines (5hmC), an epigenetic marker with a distinct role in cancer pathobiology, yet under-investigated due largely to technical constraints. METHODS: We used the TAB-Array assay, a state-of-the-art technology to directly profile 5hmC at single base resolution with the Illumina EPIC array (>850,000 CpG sites) in 17 pairs of tumor/adjacent tissue samples from US patients. RESULTS: We demonstrated distinctive distributions of 5hmC in tissues, and substantial differences between tumor and adjacent tissues, suggesting their diagnostic/prognostic value of for PaC. CONCLUSION: This study established the potential of 5hmC as a novel epigenetic biomarker for PaC.

The lack of highly sensitive and specific diagnostic biomarkers is a major contributor to the poor outcomes of patients with hepatocellular carcinoma (HCC), the second-most common cause of cancer deaths worldwide. We sought to develop a clinically convenient and minimally-invasive approach that can be deployed at scale for the sensitive, specific, and highly reliable diagnosis of HCC, and to evaluate the potential prognostic value of this approach. The study cohort comprised of 2,728 subjects, including HCC patients (n = 1,208), controls (n = 965) (572 healthy individuals and 393 patients with benign lesions), as well as patients with chronic hepatitis B infection (CHB) (n =291), liver cirrhosis (LC) (n= 110), and cholangio-carcinoma (CCC) (n = 154), was recruited from three major liver cancer hospitals in Shanghai, China, from July 2016 to November 2017. Circulating cell-free DNA (cfDNA) were collected from plasma samples from these individuals before surgery or any radical treatment. Applying our 5hmC-Seal technique, the summarized 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) pro-files in cfDNA were obtained. Molecular annotation analysis suggested that the profiled 5hmC loci in cfDNA were enriched with liver tissue-derived regulatory markers (e.g., H3K4me1). We showed that a weighted diagnostic score (wd-score) based on 117 genes detected using the summarized 5hmC profiles in cfDNA accurately distinguished HCC patients from controls (AUC = 95.1%; 95% CI, 93.6-96.5%) in the validation set, markedly outperformed α-fetoprotein (AFP) with superior sensitivity. The wd-scores, which not only detected early BCLC stages (e.g., Stage 0: AUC = 96.2%; 95% CI, 94.1-98.4%) and small tumors (e.g., < 2 cm: AUC = 95.7%; 95% CI: 93.6-97.7%), also showed high capacity for distinguishing HCC from non-cancer patients with CHB/LC (AUC = 80.2%; 95% CI, 75.8-84.6%). Moreover, the prognostic value of 5hmC markers in cfDNA was evaluated for HCC recurrence, showing that a weighted prognostic score (wp-score) based on 16 marker genes predicted the recurrence risk (HR = 6.67; 95% CI, 2.81-15.82, p < 0.0001) in 555 patients who have been followed up after surgery. In conclusion, we have developed and validated a robust 5hmC-based diagnostic model that can be applied routinely with clinically feasible amount of cfDNA (e.g., from ~2-5 mL of plasma). Applying this new approach in the clinic could significantly improve the clinical outcomes of HCC patients, for example by early detection of those patients with surgically resectable tumors or as a convenient disease surveillance tool for recurrence.

7566 Background: Multiple myeloma (MM), a B-cell neoplasm characterized by bone marrow infiltration of malignant plasma cells, is the second most common blood malignancy, with an estimated number of ~35,000 new patients annually in the United States. The molecular pathogenesis of MM is complex and involves various genetic and epigenetic alterations. Key molecular mechanisms, including chromosomal abnormalities such as translocations involving the immunoglobulin heavy chain locus and various oncogenes (e.g., MMSET, FGFR3, CCND1, MAF), alterations in epigenetic regulators (e.g., EZH2, DNMT3A), dysregulation of cell cycle control, and aberrant activation of signaling pathways (e.g., NF-kB, PI3K/AKT, and JAK/STAT), play critical roles in MM pathogenesis. However, epigenetic pathways implicated in MM has not been comprehensively investigated, partly due to technical limitations that cannot distinguish major cytosine modification types. Methods: Using the 5hmC-Seal, a highly sensitive chemical labeling technique, we profiled genome-wide 5-hydroxymethylcytosines (5hmC) in circulating cell-free DNA (cfDNA) from a population-based case-control study of MM (cases, n = 313; controls, n = 317) conducted in Canada. Results: The 5hmC modification levels were summarized for various genomic features, showing an enrichment in gene bodies and enhancer markers, consistent with the putative role of gene regulation for 5hmC modification. A genome-wide scan of gene bodies identified 771 differential features between cases and controls, adjusting for age, sex, smoking status, education, and first two principal components, at a permutation-based empirical p-value cutoff of 10 -4 . For instance, IL1RAP, a component of the interleukin-1 signaling cascade, may impact tumor progression and immune system evasion. Furthermore, functional analysis indicated canonical pathways associated with MM pathology and treatment, such as calcium signaling, and synthesis and secretion of cortisol/aldosterone, were enriched in the differential 5hmC features between cases and controls. Notably, the calcium signaling pathway, integral to Ca 2+ transport and involved in various physiological and pathological processes, plays a critical role in MM pathogenesis. Within this pathway, the CAMK1D gene, which has been identified as a crucial regulator of tumor-intrinsic immune resistance, showed differential 5hmC level between cases and controls, highlighting a vital connection between epigenetic modifications and immune evasion mechanisms in MM. Conclusions: Leveraging a state-of-the-art technique, we identified novel epigenetic modifications and pathways in the risk of MM. This approach establishes a solid foundation for further investigating etiology of MM, deepening our understanding of the disease, and advancing the discovery of biomarkers, which could potentially guide preventive strategies.