While there has been progress in the de novo design of small globular miniproteins (50-65 residues) to bind to primarily concave regions of a target protein surface, computational design of minibinders to convex binding sites remains an outstanding challenge due to low level of overall shape complementarity. Here, we describe a general approach to generate computationally designed proteins which bind to convex target sites that employ geometrically matching concave scaffolds. We used this approach to design proteins binding to TGFβRII, CTLA-4 and PD-L1 which following experimental optimization have low nanomolar to picomolar affinities and potent biological activity. Co-crystal structures of the TGFβRII and CTLA-4 binders in complex with the receptors are in close agreement with the design models. Our approach provides a general route to generating very high affinity binders to convex protein target sites.

Abstract Abiotic d -proteins that selectively bind to natural l -proteins have gained significant biotechnological interest. However, the underlying structural principles governing such heterochiral protein–protein interactions remain largely unknown. In this study, we present the de novo design of d -proteins consisting of 50–65 residues, aiming to target specific surface regions of l -proteins or l -peptides. Our designer d -protein binders exhibit nanomolar affinity toward an artificial l -peptide, as well as two naturally occurring proteins of therapeutic significance: the D5 domain of human tropomyosin receptor kinase A (TrkA) and human interleukin-6 (IL-6). Notably, these d -protein binders demonstrate high enantiomeric specificity and target specificity. In cell-based experiments, designer d -protein binders effectively inhibited the downstream signaling of TrkA and IL-6 with high potency. Moreover, these binders exhibited remarkable thermal stability and resistance to protease degradation. Crystal structure of the designed heterochiral d -protein– l -peptide complex, obtained at a resolution of 2.0 Å, closely resembled the design model, indicating that the computational method employed is highly accurate. Furthermore, the crystal structure provides valuable information regarding the interactions between helical l -peptides and d -proteins, particularly elucidating a novel mode of heterochiral helix–helix interactions. Leveraging the design of d -proteins specifically targeting l -peptides or l -proteins opens up avenues for systematic exploration of the mirror-image protein universe, paving the way for a diverse range of applications.

The Janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT) pathway serves as a paradigm for signal transduction from the extracellular environment to the nucleus. It plays a pivotal role in physiological functions, such as hematopoiesis, immune balance, tissue homeostasis, and surveillance against tumors. Dysregulation of this pathway may lead to various disease conditions such as immune deficiencies, autoimmune diseases, hematologic disorders, and cancer. Due to its critical role in maintaining human health and involvement in disease, extensive studies have been conducted on this pathway, ranging from basic research to medical applications. Advances in the structural biology of this pathway have enabled us to gain insights into how the signaling cascade operates at the molecular level, laying the groundwork for therapeutic development targeting this pathway. Various strategies have been developed to restore its normal function, with promising therapeutic potential. Enhanced comprehension of these molecular mechanisms, combined with advances in protein engineering methodologies, has allowed us to engineer cytokines with tailored properties for targeted therapeutic applications, thereby enhancing their efficiency and safety. In this review, we outline the structural basis that governs key nodes in this pathway, offering a comprehensive overview of the signal transduction process. Furthermore, we explore recent advances in cytokine engineering for therapeutic development in this pathway.

Endocytosis and lysosomal trafficking of cell surface receptors can be triggered by endogenous ligands. Therapeutic approaches such as lysosome-targeting chimaeras