Abstract Abstract The asialoglycoprotein receptor 1 (ASGR1), a multivalent carbohydrate-binding receptor that primarily is responsible for recognizing and eliminating circulating glycoproteins with exposed galactose (Gal) or N -acetylgalactosamine (GalNAc) as terminal glycan residues, has been implicated in modulating the lipid metabolism and reducing cardiovascular disease burden. In this study, we investigated the impact of ASGR1 deficiency (ASGR1 −/−) on atherosclerosis by evaluating its effects on plaque formation, lipid metabolism, circulating immunoinflammatory response, and circulating N -glycome under the hypercholesterolemic condition in ApoE-deficient mice. After 16 weeks of a western-type diet, ApoE −/− /ASGR1 −/− mice presented lower plasma cholesterol and triglyceride levels compared to ApoE −/− . This was associated with reduced atherosclerotic plaque area and necrotic core formation. Interestingly, ApoE −/− /ASGR1 −/− mice showed increased levels of circulating immune cells, increased AST/ALT ratio, and no changes in the N -glycome profile and liver morphology. The liver of ApoE −/− /ASGR1 −/− mice, however, presented alterations in the metabolism of lipids, xenobiotics, and bile secretion, indicating broader alterations in liver homeostasis beyond lipids. These data suggest that improvements in circulating lipid metabolism and atherosclerosis in ASGR1 deficiency is paralleled by a deterioration of liver injury. These findings point to the need for additional evaluation before considering ASGR1 as a pharmacological target for dyslipidemia and cardiovascular disorders. Graphical abstract

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public grant(s) – EU funding. Main funding source(s): Italian Ministry of Health - Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN); European Commission - PNRR Missione 4 (Progetto CN3 - National Center for Gene Therapy and Drugs based on RNA Technology); European Commission - PNRR Missione 4 (Progetto MUSA- Multilayered Urban Sustainability Action; European Commission - PNRR Missione 6 Background High Fat Diets (HFDs) promote inflammation in cardio-metabolic diseases by epigenetically activating the inflammasome and inducing an unfavorable oxidative metabolic skewing in long-living hematopoietic cells (1,2). Whether these mechanisms also activate the short-living neutrophils, which rely on other mechanisms of action and metabolic demands (3), is less clear. Yet, multiple neutrophil entities co-exist in blood and tissues and "age" during their short-term half-life, by virtue of a reciprocal regulation of CXCR4, that promotes a "fresh" status when these cells leave the bone marrow, and CXCR2, that accelerates their aging when they are committed against pathogens (4). Purpose Derailed aging is critical for the innate functions of neutrophils and we study whether it also contributes to exacerbate the metabolic and inflammatory consequences of HFD. Methods We immunophenotyped neutrophils and characterized the metabolic responses in physiology (wild-type mice, WT) and in mice with either constitutively aged neutrophils (MRP8 driven conditional deletion of CXCR4; herein CXCR4fl/flCre+) or with constitutively fresh neutrophils (MRP8 driven conditional deletion of CXCR2; CXCR2fl/flCre+), following 20 weeks of HFD feeding (45% Kcal from fat). Results After 20 weeks HFD, the gluco-metabolic profile of CXCR4fl/flCre+ mice was comparable to that of WT mice, while CXCR2fl/flCre+ mice were protected from obesity and insulin resistance. At 20 weeks CXCR4fl/flCre+ accumulated more in liver but CXCR2fl/flCre+ neutrophils infiltrated less. Also, CXCR4fl/flCre+, but not CXCR2fl/flCre+ neutrophils, infiltrated more in the liver two hours after an intragastric gavage with olive oil versus fasting. As this finding was not observed when these mice models were fed 20 weeks a standard fat diet, these findings suggest that HFD feeding primes a preferential relocation of aged neutrophil in the liver. Consequently, the liver of CXCR4fl/flCre+ mice presented with enriched oxidative metabolism and pathways related to NETosis/inflammation, while pathways related to physiological patrolling and resolutive inflammation were more enriched in the liver of the CXCR2fl/flCre+ counterpart. Finally, CXCR4fl/flCre+, mice also accumulated more in the visceral adipose tissue (VAT), and this resulted into altered lymphocytic cell architecture. By contrast, the reduced infiltration of CXCR2fl/flCre+ neutrophils in VAT correlated with less amount of pro-inflammatory macrophages. In humans, increased plasma levels of Cxcl1 (ligand of CXCR2) correlated with visceral obesity and metabolic syndrome. Conclusions Neutrophil aging might contribute to the cardio-metabolic consequences of HFD (Picture 1). Future studies are needed to understand the mechanism and propose the aging as a therapeutic target over and above the pathways targeted by the actual "anti-inflammasome" therapies approved for the treatment of cardiovascular diseases.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public Institution(s). Main funding source(s): University of Milan Background Kupffer Cells (KC) are hepatic resident macrophages that are essential for liver physiology and contribute to the development of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD). The liver of patients with NAFLD shows different expression of some key regulators of inner mitochondrial membrane fusion compared with healthy subjects, including OPA1 protein, which is a mitochondrial protein whose activity promotes mitochondrial fusion and positive modulation of oxidative phosphorylation. Aim Given that Kupffer Cells have both immune and metabolic roles, their mitochondria are critical for their and energy requirements and their functionality. This project aims to study how the inhibition of OPA1-driven mitochondrial fusion affects immune-metabolic response and progression of NAFLD by exploring the role of OPA1 in both a Standard and High-fat diet context. Methods mice selectively lacking OPA1 in Kupffer Cells were fed with either a Standard diet or a High-fat diet for 20 weeks. The metabolic phenotype was assessed by in vivo indirect calorimetry, measurement of plasma and tissue lipid profile, glucose and insulin sensitivity assays, and complete immunophenotype characterization. Single cell RNA sequencing was also performed to profile with higher resolution the impact of OPA1 deficiency on Kupffer Cell function and cross talk with other liver cells types within the hepatic niche. Results Under Standard diet conditions mice selectively lacking OPA1 in Kupffer Cells show a significant reduction in the KC1 pro-inflammatory subset, while the pro-resolutive KC2 increases significantly. In addition, mice lacking OPA1 in KCs show a metabolic preference towards carbohydrates, despite comparable energy expenditure, O2 consumption and CO2 production. The systemic immune profile was comparable between the two groups, with an expected reduction in KC total number under High-fat diet conditions, where no significant differences were observed between the two groups in plasma cholesterol and triglyceride levels, while a significant reduction in liver fibrosis was observed with liver histology. Conclusions Taken together these preliminary data suggest that OPA1-mediated inhibition of mitochondrial fusion in Kupffer Cells affects the systemic metabolic response under Standard diet with a reflection also on High-fat diet conditions, where systemic metabolism is comparable between the two groups, but the loss of OPA1 appears to influence the progression of NAFLD through a reduction in total liver fibrosis. Ongoing studies aim to understand the molecular mechanisms underlying these different immune-metabolic responses.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public Institution(s). Main funding source(s): University of Milan Background Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) is a hepatokine and a regulator of lipid and lipoprotein metabolism through lipoprotein lipase and endothelial lipase inhibition, preventing the hydrolyzation of lipoprotein-derived triglycerides. A lack of ANGPTL3 results into a hypolipidemic phenotype, with a lower profile of lipids and lipoproteins, and this is evident in humans carrying a loss of function mutation, or in cellular or in vivo models. ANGPTL3 action, from the liver, is finely regulated between oxidative and storage tissues in the fasting and postprandial phases; from the current pharmacological treatments a possible ANGPTL3 intrahepatic role besides the lipases’ inhibition is emerging, thus possibly affecting the systemic metabolism with different implications. Purpose An axis between ANGPTL3 and other Angiopoietin-like proteins is known to regulate the triglyceride partitioning after a meal or during fasting, however the effect on tissues and the following metabolic and pathologic implications are still not known. Therefore, we aim to describe the impact of ANGPTL3 deficiency in fasting or in a postprandial state, and in different compartments of the organism. Methods As models, we utilized Angptl3 Knock-out (KO) mice (C57BL6/J background) and their littermate controls (wild-type, WT) fed a chow diet for 16 weeks. We assessed the metabolic phenotype with indirect calorimetry and with lipids, glucose, and insulin tolerance tests; we evaluated changes in plasma lipids under fast, fed, and fast-refeed settings and we investigated the histology of key metabolic organs. Results ANGPTL3 KO mice fed ad libitum a chow diet are hypolipidemic (plasma triglycerides levels: 42,42±8,80 mg/dL in ANGPTL3 KO mice vs. 122,02±55,09 mg/dL in WT mice; plasma cholesterol levels: 44,00±9,11 mg/dL in ANGPTL3 KO mice vs. 76,51±15,87 mg/dL in WT mice). The oral charge lipid challenge suggests that KO mice have lower lipid levels at all time points. Conclusions This preliminary profiling of ANGPTL3 KO mice under fasting and fed conditions highlights the hypolipidemia of these models, and the potentially beneficial impact of ANGPTL3 deficiency on their metabolism compared to controls.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Foundation. Main funding source(s): European Atherosclerosis Society Introduction Mitochondria are involved in cellular metabolism, energy generation, calcium homeostasis, sterol and bile acids (BAs) production. Mitochondria continuously undergo biogenesis, fusion, fission and mitophagy, maintaining a continuous balance between all forms. Purpose On these premises, we test the impact of OPA1, an inner mitochondria membrane fusion protein, on mitochondrial tethering on lipid metabolism in the liver and the atherosclerotic plaque. Methods OPA1HepKO and OPA1 TG on LDLR KO background were fed with a Western-type diet (WTD) respectively for 12 weeks. Inverse calorimetry, GTT, and LipidToleranceTest (LTT) were performed. Paraffin-embedded tissues were used for histological analysis, frozen tissues were used for OMICs analysis. VSMCs were isolated and cultured with VLDL (50 µg/ml). Results While OPA1HepKO mice display altered systemic metabolism with reduced body weight and reduced circulating lipid levels OPA1 overexpression on LDLR KO background showed significantly high cholesterol levels. OPA1 deficiency impair hepatic bile acid conjugation with significant accumulation of primary unconjugated bile acids in the liver. On the contrary OPA1 overexpression leads to a reduction of unconjugated bile acids and higher percentage of conjugated bile acids. OPA1 reduction leads to a reduced atherosclerotic plaque while, on the contrary, its overexpression doesn’t affect atherosclerosis despite an increase in circulating lipid and lipoprotein levels. OPA1 overexpression is therefore promoting plaque stabilization with VSMCs that are less prone to change their metabolism to synthetic. Conclusion Hepatic Opa1 deficiency alters bile acids production and therefore circulating lipid profile with a consequent reduction in atherosclerotic plaque formation. OPA1 overexpression in the aorta affects plaque stability despite the highest levels of circulating lipids.