SUMMARY Deeper understanding of the mechanism of the action of insulin and insulin-degrading enzyme (IDE) is a central theme in research into physiology and the pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. Despite significant progress regarding the substrate recruitment, unfolding, digestion, and release by IDE, the structure and function of the insulin hexamer during the degradation cycle of IDE remain to be fully characterized. In the present study, we have characterized the behavior of human insulin hexamer in the absence of zinc. Using cryo-electron microscopy, we also observed that these hexamers represented a structure similar to that of T 6 insulin. More interestingly, we also observed complexes in which some of their monomeric insulin components are partially distorted at their hexametric symmetry. This ensures that insulin determines the kinetics of its degradation by IDE without the requirement for zinc. These findings provide new information regarding the molecular events in insulin assembly and disassembly that permit its selective digestion by IDE.

Disulfide formation generally involves a two‐electron oxidation reaction between cysteine residues. Additionally, disulfide formation is an essential post‐translational modification for the structural maturation of proteins. This oxidative folding is precisely controlled by an electron relay network constructed by protein disulfide isomerase (PDI), with a CGHC sequence as the redox‐active site, and its family enzymes. Creating reagents that mimic the functions of these enzymes facilitates folding during chemical protein synthesis. In this study, we aimed to imitate a biological electron relay system using cyclic diselenide compounds as surrogates for endoplasmic reticulum oxidoreductin 1 (Ero1), which is responsible for the re‐oxidation of PDI. Oxidized PDI (PDIox) introduces disulfide bonds into substrate proteins, resulting in its conversion to reduced PDI (PDIred). The PDIred is then re‐oxidized to PDIox by a coexisting cyclic diselenide compound, thereby restoring the function of PDI as a disulfide‐forming agent. The produced diselenol state is readily oxidized to the original diselenide state with molecular oxygen, continuously sustaining the PDI catalytic cycle. This artificial electron relay system regulating enzymatic PDI function effectively promotes the oxidative folding of disulfide‐containing proteins, such as insulin—a hypoglycemic formulation—by enhancing both yield and reaction velocity.

Abstract Microphysiological systems (MPS), also known as Organ(s)-on-Chip (OoC), are in vitro cell culture platforms that reproduce the function of cells/tissues/organs in a microenvironment. To closely mimic in vivo physiological functions, MPS must allow the cells to attain three-dimensional arrangements and be supplied with adequate oxygen and growth factors (via microfluidic channels). Furthermore, as MPS are mostly used in cell-based drug development assays, they must ensure easy analysis and high usability. To make MPS which conform to these various requirements, it is crucial to select appropriate materials; oftentimes, MPS-appropriate materials have been developed. Here, we review the functions and properties of materials used to make MPSs and summarize the specifications, considerations, and selection methods employed in choosing appropriate materials and technologies to fabricate MPS that meet standard requirements. Where possible, we give specific examples to explain several important functions. The functions of the chosen material for MPS depend on the context of use (COU) in the drug development process. Because of the diverse COUs, the material selection strategies and the processes used to fabricate required material functionalities are complex. We also discuss the importance of standardizing MPS material and recent international efforts made in this direction.

Abstract The endoplasmic reticulum (ER) plays key roles in protein quality control 1,2 and dynamic Ca 2+ storage 3,4 in eukaryotic cells. However, the protein homeostasis (proteostasis) system that regulates these ER functions is still incompletely characterised. Previous study revealed the importance of oligomerization in the function PDIA1, an ER-resident disulfide isomerase and molecular chaperone, regulates oligomeric states in accordance with client folding 5 . This result suggests that at least some of the 20 members of other PDI family may undergo regulated self-assembly in order to optimally function. Here, we show that Ca 2+ triggers the phase separation of PDIA6 into liquid-like condensates. In contrast to the condensation mechanism observed for proteins containing low-complexity domains, our results indicate that transient but specific electrostatic interactions occur between the first and the third folded thioredoxin-like domains of PDIA6. We further show that the Ca 2+ -driven condensation of PDIA6 recruits PDIA3 and proinsulin, thus increasing their local concentrations. This process results in the 30-fold enhancement of proinsulin folding and in the inhibition of proinsulin aggregation. Our findings shed light on a condensation-driven Ca 2+ -mediated proteostasis cascade in the ER by revealing how the efficiency of the protein folding process can be enhanced within quality control granules.

Glycolipid metabolism occurs in the Golgi apparatus, but the detailed mechanisms have not yet been elucidated. We used fluorescently labeled glycolipids to analyze glycolipid composition and localization changes and shed light on glycolipid metabolism. In a previous study, the fatty chain of lactosyl ceramide was fluorescently labeled with BODIPY (LacCer-BODIPY) before being introduced into cultured cells to analyze the cell membrane glycolipid recycling process. However, imaging analysis of glycolipid recycling is complicated because of limited spatial resolution. Therefore, we examined the microscopic conditions that allow the temporal analysis of LacCer-BODIPY trafficking and localization. We observed that the glycolipid fluorescent probe migrated from the cell membrane to intracellular organelles before returning to the cell membrane. We used confocal microscopy to observe co-localization of the glycolipid probe with endosomes and Golgi markers, demonstrating that it recycles mainly through the trans-Golgi network (TGN). Here, a glycolipid recycling pathway was observed that did not require the lipids to pass through the lysosome.

The [C11U A ,C11U B ] and [C10U A ,C15U A ] variants of human relaxin-2, which were synthesized via a one-pot assembly of the component A- and B-chains, efficiently reduced the expression of a tissue fibrosis-related factor in endometriotic stromal cells.