Dating Wood Rot Specific lineages within the basidiomycete fungi, white rot species, have evolved the ability to break up a major structural component of woody plants, lignin, relative to their non–lignin-decaying brown rot relatives. Through the deep phylogenetic sampling of fungal genomes, Floudas et al. (p. 1715 ; see the Perspective by Hittinger ) mapped the detailed evolution of wood-degrading enzymes. A key peroxidase and other enzymes involved in lignin decay were present in the common ancestor of the Agaricomycetes. These genes then expanded through gene duplications in parallel, giving rise to white rot lineages.

The structure of the lignin in wheat straw has been investigated by a combination of analytical pyrolysis, 2D-NMR, and derivatization followed by reductive cleavage (DFRC). It is a p-hydroxyphenyl-guaiacyl-syringyl lignin (with an H:G:S ratio of 6:64:30) associated with p-coumarates and ferulates. 2D-NMR indicated that the main substructures present are β-O-4′-ethers (∼75%), followed by phenylcoumarans (∼11%), with lower amounts of other typical units. A major new finding is that the flavone tricin is apparently incorporated into the lignins. NMR and DFRC indicated that the lignin is partially acylated (∼10%) at the γ-carbon, predominantly with acetates that preferentially acylate guaiacyl (12%) rather than syringyl (1%) units; in dicots, acetylation is predominantly on syringyl units. p-Coumarate esters were barely detectable (<1%) on monomer conjugates released by selectively cleaving β-ethers in DFRC, indicating that they might be preferentially involved in condensed or terminal structures.

ABSTRACT Ten phenols were selected as natural laccase mediators after screening 44 different compounds with a recalcitrant dye (Reactive Black 5) as a substrate. Their performances were evaluated at different mediator/dye ratios and incubation times (up to 6 h) by the use of Pycnoporus cinnabarinus and Trametes villosa laccases and were compared with those of eight known synthetic mediators (including -NOH- compounds). Among the six types of dyes assayed, only Reactive Blue 38 (phthalocyanine) was resistant to laccase-mediator treatment under the conditions used. Acid Blue 74 (indigoid dye), Reactive Blue 19 (anthraquinoid dye), and Aniline Blue (triarylmethane-type dye) were partially decolorized by the laccases alone, although decolorization was much more efficient and rapid with mediators, whereas Reactive Black 5 (diazo dye) and Azure B (heterocyclic dye) could be decolorized only in the presence of mediators. The efficiency of each natural mediator depended on the type of dye to be treated but, with the only exception being Azure B (<50% decolorization), nearly complete decolorization (80 to 100%) was attained in all cases. Similar rates were attained with the best synthetic mediators, but the reactions were significantly slower. Phenolic aldehydes, ketones, acids, and esters related to the three lignin units were among the best mediators, including p -coumaric acid, vanillin, acetovanillone, methyl vanillate, and above all, syringaldehyde and acetosyringone. The last two compounds are especially promising as ecofriendly (and potentially cheap) mediators for industrial applications since they provided the highest decolorization rates in only 5 to 30 min, depending on the type of dye to be treated.

Brown-rot fungi such as Postia placenta are common inhabitants of forest ecosystems and are also largely responsible for the destructive decay of wooden structures. Rapid depolymerization of cellulose is a distinguishing feature of brown-rot, but the biochemical mechanisms and underlying genetics are poorly understood. Systematic examination of the P. placenta genome, transcriptome, and secretome revealed unique extracellular enzyme systems, including an unusual repertoire of extracellular glycoside hydrolases. Genes encoding exocellobiohydrolases and cellulose-binding domains, typical of cellulolytic microbes, are absent in this efficient cellulose-degrading fungus. When P. placenta was grown in medium containing cellulose as sole carbon source, transcripts corresponding to many hemicellulases and to a single putative β-1–4 endoglucanase were expressed at high levels relative to glucose-grown cultures. These transcript profiles were confirmed by direct identification of peptides by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Also up-regulated during growth on cellulose medium were putative iron reductases, quinone reductase, and structurally divergent oxidases potentially involved in extracellular generation of Fe(II) and H 2 O 2 . These observations are consistent with a biodegradative role for Fenton chemistry in which Fe(II) and H 2 O 2 react to form hydroxyl radicals, highly reactive oxidants capable of depolymerizing cellulose. The P. placenta genome resources provide unparalleled opportunities for investigating such unusual mechanisms of cellulose conversion. More broadly, the genome offers insight into the diversification of lignocellulose degrading mechanisms in fungi. Comparisons with the closely related white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium support an evolutionary shift from white-rot to brown-rot during which the capacity for efficient depolymerization of lignin was lost.

Three peroxidases involved in lignin degradation are produced by white-rot fungi. Lignin peroxidase (LiP) is characterized by oxidation of high redox-potential aromatic compounds (including veratryl alcohol) whereas manganese peroxidase (MnP) requires Mn2+ to complete the catalytic cycle and forms Mn3+ chelates acting as diffusing oxidizers. Pleurotus and Bjerkandera versatile peroxidase (VP) is able to oxidize Mn2+ as well as non-phenolic aromatic compounds, phenols and dyes. Phanerochaete chrysosporium has two gene families including ten LiP-type and three MnP-type genes coding different isoenzymes expressed during secondary metabolism. Two VP genes have been recently cloned from Pleurotus eryngii. Phanerochaete chrysosporium MnP and P. eryngii VP are induced by H2O2, being Mn2+ involved in regulation of their transcript levels. At least eighteen more ligninolytic peroxidase genes have been cloned from other white-rot fungi. Protein sequence comparison reveals that typical MnP from P. chrysosporium and two other fungi (showing a longer C-terminal tail) are separated from other ligninolytic peroxidases, which form two main groups including P. chrysosporium LiP and Pleurotus peroxidases respectively. LiP and MnP crystal structures and VP theoretical molecular models are available. The high redox potential of ligninolytic peroxidases seems related to the distance between heme iron and proximal histidine, and the ability of MnP to oxidize Mn2+ is due to a Mn-binding site formed by three acidic residues near the internal heme propionate. Pleurotus eryngii VP show higher sequence and structural affinities with P. chrysosporium LiP than MnP, but includes a Mn-binding site accounting for its ability to oxidize Mn2+. The functionality of this site was demonstrated by site-directed mutagenesis of MnP and VP. All fungal peroxidases, which exhibit similar topology (11–12 helices) and folding, also include binding sites for two structural Ca2+. Veratryl alcohol was first modeled near LiP heme, but evidence for oxidation at the protein surface via a long-range electron transfer pathway has accumulated. Chemical and site-directed mutagenesis modification confirmed that an exposed tryptophan is involved in veratryl alcohol oxidation however, multiple sites could be responsible for oxidation of different aromatic substrates and dyes by these peroxidases.

Lignin changes during plant growth were investigated in a selected Eucalyptus globulus clone. The lignin composition and structure were studied in situ by a new procedure enabling the acquisition of two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D-NMR) spectra on wood gels formed in the NMR tube as well as by analytical pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry. In addition, milled-wood lignins were isolated and analyzed by 2D-NMR, pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry, and thioacidolysis. The data indicated that p-hydroxyphenyl and guaiacyl units are deposited at the earlier stages, whereas the woods are enriched in syringyl (S) lignin during late lignification. Wood 2D-NMR showed that β-O-4′ and resinol linkages were predominant in the eucalypt lignin, whereas other substructures were present in much lower amounts. Interestingly, open β-1′ structures could be detected in the isolated lignins. Phenylcoumarans and cinnamyl end groups were depleted with age, spirodienone abundance increased, and the main substructures (β-O-4′ and resinols) were scarcely modified. Thioacidolysis revealed a higher predominance of S units in the ether-linked lignin than in the total lignin and, in agreement with NMR, also indicated that resinols are the most important nonether linkages. Dimer analysis showed that most of the resinol-type structures comprised two S units (syringaresinol), the crossed guaiacyl-S resinol appearing as a minor substructure and pinoresinol being totally absent. Changes in hemicelluloses were also shown by the 2D-NMR spectra of the wood gels without polysaccharide isolation. These include decreases of methyl galacturonosyl, arabinosyl, and galactosyl (anomeric) signals, assigned to pectin and related neutral polysaccharides, and increases of xylosyl (which are approximately 50% acetylated) and 4-O-methylglucuronosyl signals.

Efficient lignin depolymerization is unique to the wood decay basidiomycetes, collectively referred to as white rot fungi. Phanerochaete chrysosporium simultaneously degrades lignin and cellulose, whereas the closely related species, Ceriporiopsis subvermispora, also depolymerizes lignin but may do so with relatively little cellulose degradation. To investigate the basis for selective ligninolysis, we conducted comparative genome analysis of C. subvermispora and P. chrysosporium . Genes encoding manganese peroxidase numbered 13 and five in C. subvermispora and P. chrysosporium , respectively. In addition, the C. subvermispora genome contains at least seven genes predicted to encode laccases, whereas the P. chrysosporium genome contains none. We also observed expansion of the number of C. subvermispora desaturase-encoding genes putatively involved in lipid metabolism. Microarray-based transcriptome analysis showed substantial up-regulation of several desaturase and MnP genes in wood-containing medium. MS identified MnP proteins in C. subvermispora culture filtrates, but none in P. chrysosporium cultures. These results support the importance of MnP and a lignin degradation mechanism whereby cleavage of the dominant nonphenolic structures is mediated by lipid peroxidation products. Two C. subvermispora genes were predicted to encode peroxidases structurally similar to P. chrysosporium lignin peroxidase and, following heterologous expression in Escherichia coli , the enzymes were shown to oxidize high redox potential substrates, but not Mn 2+ . Apart from oxidative lignin degradation, we also examined cellulolytic and hemicellulolytic systems in both fungi. In summary, the C. subvermispora genetic inventory and expression patterns exhibit increased oxidoreductase potential and diminished cellulolytic capability relative to P. chrysosporium .

Aryl-alcohol oxidase (AAO) shows a pronounced duality as oxidase and dehydrogenase similar to that described for other glucose-methanol-choline (GMC) oxidase/dehydrogenase superfamily proteins involved in lignocellulose decomposition. In this work, we detail the overall mechanism of AAOs from