Transmitochondrial cybrids and multiple OMICs approaches were used to understand mitochondrial reprogramming and mitochondria-regulated cancer pathways in triple-negative breast cancer (TNBC). Analysis of cybrids and established breast cancer (BC) cell lines showed that metastatic TNBC maintains high levels of ATP through fatty acid β oxidation (FAO) and activates Src oncoprotein through autophosphorylation at Y419. Manipulation of FAO including the knocking down of carnitine palmitoyltransferase-1A (CPT1) and 2 (CPT2), the rate-limiting proteins of FAO, and analysis of patient-derived xenograft models confirmed the role of mitochondrial FAO in Src activation and metastasis. Analysis of TCGA and other independent BC clinical data further reaffirmed the role of mitochondrial FAO and CPT genes in Src regulation and their significance in BC metastasis.

Abstract Pancreatic adenocarcinoma is a devastating disease with an abysmal survival rate of 9%. A robust fibro-inflammatory and desmoplastic stroma, characteristic of pancreatic cancer, contributes to the challenges in developing viable therapeutic strategies in this disease. Apart from constricting blood vessels and preventing efficient drug delivery to the tumor, the stroma also contributes to aggressive biology of the cancer along with its immune-evasive microenvironment. In this study, we show that in pancreatic tumors, the developing stroma increases tumor initiation frequency in pancreatic cancer cells in vivo by enriching for CD133+ aggressive “stem-like” cells. Additionally, the stromal fibroblasts secrete IL6 as the major cytokine, increases glycolytic flux in the pancreatic tumor cells and increases lactate efflux in the microenvironment via activation of the STAT signaling pathway. We also show that the secreted lactate favors activation of M2 macrophages in the tumor microenvironment, which excludes CD8+ T-cells in the tumor. Our data additionally confirms that treatment of pancreatic tumors with anti-IL6 antibody results in tumor regression as well as decreased CD133+ population within the tumor. Furthermore, inhibiting the lactate efflux in the microenvironment reduces M2 macrophages, and makes pancreatic tumors more responsive to anti-PD1 therapy. This suggests that stromal IL6 driven metabolic reprogramming plays a significant role in the development of an immune evasive microenvironment. In conclusion, our study shows that targeting the metabolic pathways affected by stromal IL6 can make pancreatic tumors amenable to checkpoint inhibitor therapy.

Abstract 2-hydroxyglutarate (2-HG) has gained considerable importance in glioma and blood cancers that have mutations in the IDH1/2 gene. In the current study we show for the first time that pancreatic tumors produce 2HG in the absence of IDH1/2 mutation. Our study shows that hypoxic pancreatic tumors that have activated lactate dehydrogenase (LDH) activity, produce the L-isoform of 2HG. Metabolic mass spectrometric analysis along with chiral derivatization showed that pancreatic cancer cells as well as stromal cells secrete the L-isomeric form of 2-hydroxyglutarate (L-2HG) when exposed to hypoxic environment. Serum analysis of human pancreatic cancer patients also showed similar accumulation of L-2HG. Our results showed that this abnormally accumulated L-2HG regulates self-renewal by increasing expression of genes associated with stemness (Sox-2, CD133) and by decreasing expression of differentiation genes (Pdx-1, HB9, NKX6.1). Further analysis showed that secreted L-2HG mediates cross talk with immune T-cells and hampers their proliferation and migration thereby suppressing the anti-tumor immunity. In vivo targeting of LDH enzyme with inhibitor (GSK2837808A) showed decrease in L-2HG as well as subsequent tumor regression and sensitization to immune-checkpoint therapy. Present study shows for the first time that hypoxia mediated accumulation of L-2HG drives self-renewal in pancreatic cancer by shifting critical balance of gene expression towards stemness and promotes immune suppression by impairing T cell activation in this disease. Additionally, it indicates that targeting LDH can sensitize pancreatic tumors to anti-PD1 therapy by decreasing L-2HG and reverting their immune evasive function.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is considered to be a highly immunosuppressive and heterogenous neoplasm. Despite improved knowledge regarding the genetic background of the tumor and better understanding of the tumor microenvironment, immune checkpoint inhibitor therapy (targeting CTLA-4, PD-1, PD-L1) has not been very successful against PDAC.The robust desmoplastic stroma, along with an extensive extracellular matrix (ECM) that is rich in hyaluronan, plays an integral role in this immune evasion. Hexosamine biosynthesis pathway (HBP), a shunt pathway of glycolysis, is a metabolic node in cancer cells that can promote survival pathways on one hand and influence the hyaluronan synthesis in the ECM on the other. The rate-limiting enzyme of the pathway, glutamine-fructose amidotransferase (GFAT1), uses glutamine and fructose 6-phosphate to eventually synthesize UDP-GlcNAc.In the current manuscript, we target this glutamine-utilizing enzyme by a small molecule glutamine analog (6-diazo-5-oxo-L-norleucine or DON). Our results show that DON decreases the self-renewal potential and metastatic ability of tumor cell. Further, treatment with DON results in a decrease in hyaluronan and collagen in the tumor microenvironment, leading to an extensive remodeling of the ECM. this in turn, increases CD8+ cytotoxic T-cells infiltration, and makes the tumors tumors more amenable and sensitive to anti-PD1 therapy.

Presence of quiescent, therapy evasive population often described as cancer stem cells (CSC) or tumor initiating cells (TIC) is often attributed to extreme metastasis and tumor recurrence. This population is typically enriched in a tumor as a result of microenvironment or chemotherapy induced stress. The TIC population adapts to this stress by turning on cell cycle arrest programs that is a fail-safe mechanism to prevent expansion of malignant cells to prevent further injury. Upon removal of the stress conditions, these cells restart their cell cycle and regain their proliferative nature thereby resulting in tumor relapse. Growth Arrest Specific 5 (GAS5) is a long- noncoding RNA that plays a vital role in this process. In pancreatic cancer, CD133+ population is a typical representation of the TIC population that is responsible for tumor relapse. In this study, we show for the first time that emergence of CD133+ population coincides with upregulation of GAS5, that reprograms the cell cycle to slow proliferation by inhibiting GR mediated cell cycle control. The CD133+ population further routed metabolites like glucose to shunt pathways like pentose phosphate pathway, that were predominantly biosynthetic in spite of being quiescent in nature but did not use it immediately for nucleic acid synthesis. Upon inhibiting GAS5, these cells were released from their growth arrest and restarted the nucleic acid synthesis and proliferation. Our study thus showed that GAS5 acts as a molecular switch for regulating quiescence and growth arrest in CD133+ population, that is responsible for aggressive biology of pancreatic tumors.

Minnelide is a water-soluble disodium salt variant of triptolide, an HSP70 inhibitor that can prevent tumor progression and induce apoptosis. Maximum tolerated dose (MTD), safety, and antitumor activity of Minnelide alone and its combination with paclitaxel were evaluated in this open-label, single-center, dose-escalation phase I study (NCT05566834) in patients who were previously treated for advanced gastric cancer (AGC). Minnelide was administered orally using a 3 + 3 dose-escalation design as monotherapy (Regimen A), and in combination with paclitaxel (Regimen B & C). Our results show that no patients experienced dose limiting toxicity (DLT) in the combination group (Regimen B& C) while 2 patients experienced DLT from the Regimen A group (n = 11) (Minnelide 1.5 mg). The MTD was Minnelide 1.25 mg once daily for 21days Q4 weeks as monotherapy. The most common Grade ≥3 AEs were neutropenia (19.4 %) and abdominal pain (11.1 %). In Regimen C, 71.5 % achieved either a partial response or a stable disease with the median PFS of 4.5 months, and the median OS of 10.7 months. The combination of Minnelide plus paclitaxel as salvage treatment in AGC patients showed meaningful clinical activity with a manageable safety profile. Based on these encouraging results, a phase II study is being initiated to test the effectiveness of the combination regimen in patients with advanced gastric cancer.

Pancreatic cancer is among the 3rd leading cause of cancer related deaths in the United States along with a 5-year survival rate of 7%. The aggressive biology of the disease is responsible for such dismal outcome and is manifested by an increase in self-renewal capacity of the cancer cells, which leads to an increased rate of tumor-recurrence, contributing to poor prognosis. Transcription factor SOX2 maintains a critical balance between differentiation and stemness and is thus tightly regulated within a cell. In cancer, SOX2 is aberrantly turned-on leading to activation of self-renewal pathways in cancer. Regulation of Sox2 in cancer is poorly understood. In the current study, we show for the first time that in pancreatic cancer, Sox2 is modified by addition of O-GlcNAc moiety, catalyzed by OGT (O-GlcNAc Transferase) at S246. This activates Sox2 transcriptional activity by stabilizing the protein in the nucleus. A CRISPR-OGT knockout in pancreatic cancer cell line S2VP10 resulted in a delayed tumor initiation. We further showed that mutation of this site (S246A) prevents the modification of Sox2 and its downstream activity. Our study also demonstrated that targeting OGT in vivo with a small molecule inhibitor OSMI, results in decreased tumor burden, delayed tumor progression and a decreased expression of SOX2 in pancreatic cancer cells. Our study highlights for the first time that that the O-GlcNAc transferase dependent SOX2 glycosylation has a profound effect on the transcriptional activity of SOX2 and is instrumental in determining self-renewal in pancreatic cancer.

Abstract Obesity causes a number of systemic alterations including chronic inflammation and changes in gut microbiome. However, whether these actively contribute to poor survival and therapy resistance in patients with pancreatic cancer remain undetermined. Our current study shows that high fat diet fed pancreatic tumor bearing mice do not respond to standard of care therapy with gemcitabine and paclitaxel when compared to corresponding control diet fed mice. Upon fecal matter transplant from control mice to high fat diet fed mice, the tumors became sensitive to standard of care therapy and showed extensive cell death. Analysis of gut microbiome showed an enrichment of queuosine (Q) producing bacteria in high fat diet fed mice and an enrichment of S-adenosyl methionine (SAM) producing bacteria in control diet fed mice. Further, treatment of high fat diet fed animals with SAM recapitulated the observation with lean to obese fecal matter transplant. Additionally, treatment of pancreatic and colon cancer cell lines in vitro with Q promoted resistance to the paclitaxel and oxaliplatin respectively, while treatment with SAM promoted sensitivity to these drugs. Treatment of pancreatic cancer cells with Q showed upregulation PRDX1, that is involved in oxidative stress protection. Analysis of tumor tissues in high fat diet fed mice showed high PRDX1, low apoptosis and increased proliferation, which were reversed upon treatment with SAM as well as by lean to obese fecal matter transplant. In parallel, high fat diet fed mice showed increase in CD133+ treatment refractory population compared to the control animals. Interestingly, treatment with Q in vitro did not enrich for CD133+ population, indicating that Q mediated protection from cell death was independent of enrichment of treatment refractory cells. These observations indicated that microbial metabolite Q accumulated in high fat diet fed mice protected tumors from chemotherapy induced oxidative stress by upregulating PRDX1. This protection could be reversed by treatment with SAM. We conclude that relative concentration of S-adenosyl methionine and queuosine in fecal samples of pancreatic cancer patients can be indicative of therapy response in this disease.

Abstract Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2, is the causative agent of coronavirus disease 2019, COVID-19, and the current COVID-19 pandemic. Even as more vaccine candidates are released, more treatment options are critically needed. Here, we investigated the use of Minnelide, a water soluble pro-drug with anti-inflammatory properties, for the treatment of COVID-19. To do this, k18-hACE2 mice were infected with SARS-CoV-2 or given PBS control intranasally. The next day mice were either treated daily with low dose (0.0025mg/day) or high dose Minnelide (0.005mg/day), or given vehicle control intraperitoneal. Mice were weighed daily, and sacrificed at day 6 and 10 post-infection to analyze viral burden, cytokine response, and pathology. We observed a reduction in viral load in the lungs of Minnelide-treated mice infected with SARS-CoV-2 at day 10 post-infection compared to day 6 post-infection. All SARS-CoV-2 infected non-treated mice were moribund six days post-infection while treatment with Minnelide extended survival for both low (60% survival) and high (100% survival) dose treated mice ten days post-infection. Interestingly, cytokine analysis demonstrated a significant reduction in IL-6 (lung and heart) and D-dimer (serum) in high dose treated SARS-CoV-2 infected mice compared to mice infected with SARS-CoV-2 alone at day 6 post-infection. Additionally, histology analysis revealed that Minnelide treatment significantly improved lung pathology ten days post-infection with SARS-CoV-2 with all the mice exhibiting normal lung tissue with thin alveolar septa and no inflammatory cells. Overall, our study exhibits potential for the use of Minnelide to improve survival in COVID-19 patients.

4033 Background: Minnelide is a water-soluble disodium salt variant of triptolide, an HSP70 inhibitor. Studies using pancreatic cancer cell lines and human xenograft transplants demonstrated that Minnelide prevents tumor progression, increases survival, and causes tumor regression. This study aims to evaluate the safety and antitumor activity of Minnelide and its combination with paclitaxel in patients with advanced gastric cancer (AGC). Methods: This open-label, single-center, dose-escalation phase I study recruited adult patients with previously treated advanced gastric cancer. Patients received Minnelide per oral (PO) daily starting with 1.0 mg for 3weeks and 1week rest schedule, escalating to 1.25mg, and 1.5mg. In combination Regimen, patients received Minnelide starting at a dose of 0.25 mg and escalating by 0.25mg to 1.25mg plus paclitaxel 60-80 mg/m 2 intravenously on Day 1, 8, and 15 of each cycle, administered in 4-week cycles. The primary objective was to assess the safety and determine the recommended phase II dose (RP2D). Secondary objectives included preliminary efficacy using RECIST v1.1, and survival analysis. Results: Among Regimen A (n = 11), two patients experienced dose-limiting toxicity (DLTs) (Minnelide 1.5 mg: Grade 3 abdominal pain). No DLTs occurred in combination treatment, Regimen B & C (n=25). The MTD was Minnelide 1.25 mg once daily for 21days Q4 weeks as monotherapy. The most common Grade ≥3 AEs were neutropenia (19.4%) and abdominal pain (11.1%). In Regimen C, 71.5% achieved either a partial response or a stable disease with the median PFS of 4.5 months, and the median OS of 10.7 months. Notably, patients without previous exposure to paclitaxel (n = 4) in the last 2 cohorts of Regimen C, had a confirmed ORR of 50.0%, DCR of 75.0%, the median PFS was 5.3 months (95% CI NE-NE) and the median OS has not reached as some of the patients are still receiving treatment. Conclusions: The combination of Minnelide plus paclitaxel as salvage treatment in AGC patients showed meaningful clinical activity with a manageable safety profile. Based on this Phase I experience a Phase II will be initiated in AGC patients. Clinical trial information: NCT05566834 .