5609 Background: MMRd status is a robust predictive biomarker for ICI in EC, however half of these pts do not respond. Most studies exploring biomarkers of response to ICI have focused on tumor or immune cell factors. We aimed to explore the tumor microenvironment (TME) in ICI-Responder (R) versus Non-Responder (NR) MMRd EC pts to identify new predictive biomarkers of response. Methods: Clinical data and outcomes of metastatic MMRd EC pts, treated with ICI at Gustave Roussy Institute (2016-2023), were retrospectively collected. Pts were classified as Rs (CR, PR, or SD ≥12 months) or NRs (PD or SD <12 months). Pre-ICI FFPE tumor samples were subjected to Biognosys UltraDeep TrueDiscovery™ Mass Spectrometry (MS) for the identification of differentially regulated protein expression between R and NR. Criteria for protein candidates’ selection were p-value < 0.01 and average absolute log2 fold change (absolute average Log ratio) > 0.58. CD8+ T cells were quantified in the intratumoral area and expressed as number of cells per mm 2 . Spearman correlation test (r) was used for lineal correlation calculations. Functional enrichment analysis was conducted to elucidate differentially expressed molecular signatures (Odds ratio; adjusted p-value) in Rs vs NRs, utilizing GO_Biological Process database. Results: Twenty-three tumor samples were included in the analysis: 15 from Rs and 8 from NRs. Overall, 11,187 proteins were quantified. Only 72 were found to be differentially abundant between Rs and NRs. Protein candidates present within the tumor microenvironment that were significantly UP-regulated in NRs related to: non-specific inflammation (CRP), arachidonic acid metabolism (LOX15, PTGR3), extracellular matrix synthesis (COL5A2, COL22A1, PXDN), and TGF-b (TFBR1). CRP, LOX15, PXDN and COL5A2, were negatively correlated with CD8 + T cell infiltration (r -0.23, r -0.33, r -0.51, r -0.21). Based on functional enrichment analysis, collagen fibril organization (OR 21.4; p 1.1 e -6 ), extracellular structure organization (OR 10.2; p 1.2 e -6 ), extracellular matrix (ECM) organization (OR 7.5; p 1.1e -6 ), supramolecular fiber organization (OR 3.4; p 0.03), and TGFBR signaling pathway (OR 6.4; p 0.08) were among the top 30 biological process upregulated in NRs. Conclusions: Our preliminary data on high throughput proteomic analysis identified the arachidonic acid pathway, ECM structural organization and TGF-b signaling as potential mediators of ICI resistance in MMRd EC, all of which may be actionable in an effort to enhance sensitivity to ICI.

3139 Background: Immune checkpoint inhibitor (ICI) therapy has proved efficacy in MSI colorectal (CRC) and endometrial cancer (EC), but its use in MSS tumors remains a challenge. As the mechanisms of action of CTLA-4 and PD-1 are non-redundant, targeting both pathways may have additive or synergistic activity in comparison with single PD-1/PD-L1 inhibition in MSS and MSI CRC and EC tumors, while single cell characterization of persistent cells upon treatment would enable to describe cell populations and build a detailed single-cell map of the immune, tumor and stromal cell composition. A single dose of tremelimumab (Trem) 300mg, while maintaining a similar overall exposure, has 3- to 4-fold higher Cmax compared to 4 doses of Trem 1 mg/kg, which may have the potential for better anti-tumor activity while potentially avoiding cumulative toxicity. Here we present the results of patients (pts) with refractory ICI-naïve MSS EC and CRC treated with Dur plus Trem and the characterization of immune and persistent cells with longitudinal single-cell analyses. Methods: Pts with advanced MSS/pMMR CRC and EC that have progressed during or after standard therapy with measurable disease per RECIST 1.1, ECOG ≤1, were treated with Dur 1500mg plus Trem 300mg at Week 0, followed by Dur 1500 mg Q4W. Response rate was correlated with transcriptome and T cell repertoire dynamics measured at single-cell level from freshly processed biopsies at three different timepoints: baseline, upon treatment and at progression. Results: 24 samples for single-cell analysis were obtained (4 MSS CRC and 4 MSS EC). The response rate (RR) was 0%, while disease control rate was 12.5%. Despite the lack of response, we found a massive shift in the immune tumor microenvironments of all patients. Following treatment, immune cell composition shifted to increased frequency of effector-memory, proliferating CD8 + cells and CD4 + cells, surprisingly, with enriched T helper phenotypes. Both lineages showed strong signals of exhaustion. The integration of matched T cell receptor (TCR) data pointed to an infiltration of new clonotypes, rather than the expansion of pre-existing tumor-resident T cells, with distinct degrees of dysfunctional phenotypes between the clones. Intriguingly, expanded clonotypes could be detected and monitored in peripheral blood cells using ultra-deep TCR sequencing. Conclusions: Dual treatment with Dur and Trem does not result in an improved RR in patients with refractory MSS/pMMR CRC and EC, despite profound dynamics in the tumor infiltrating immune cells landscape. The infiltration of CD4 + T helper cells provides mechanistic insights of immune evasion, a potential avenue to treat MSS/pMMR tumors. Clinical trial information: 2021-004061-13 .