Whole-genome sequencing of the protozoan pathogen Trypanosoma cruzi revealed that the diploid genome contains a predicted 22,570 proteins encoded by genes, of which 12,570 represent allelic pairs. Over 50% of the genome consists of repeated sequences, such as retrotransposons and genes for large families of surface molecules, which include trans-sialidases, mucins, gp63s, and a large novel family (>1300 copies) of mucin-associated surface protein (MASP) genes. Analyses of the T. cruzi, T. brucei , and Leishmania major (Tritryp) genomes imply differences from other eukaryotes in DNA repair and initiation of replication and reflect their unusual mitochondrial DNA. Although the Tritryp lack several classes of signaling molecules, their kinomes contain a large and diverse set of protein kinases and phosphatases; their size and diversity imply previously unknown interactions and regulatory processes, which may be targets for intervention.

We have investigated the unusual physical properties of a restriction fragment of Leishmania tarentolae kinetoplast DNA. A gel-purified fragment comprising slightly more than half of a minicircle was determined by Maxam-Gilbert sequence determination to be 490 base pairs (bp) in length. This fragment has dramatically anomalous electrophoretic behavior; it has an apparent size of 450 bp on a 1% agarose gel but migrates as 1,380 bp on a 12% polyacrylamide gel. However, in gel filtration on Sephacryl S-500, the fragment elutes with an apparent size of 375 bp. Finally, it behaves anomalously in electric dichroism experiments. Field-free rotational relaxation times from transient electric dichroism studies are highly sensitive to effective molecular dimensions. The rotational relaxation time of the kinetoplast fragment is smaller than that of a 309-bp control fragment from pBR322. Because rigorous control experiments rule out the possibility that this fragment is modified, these anomalous properties must be dictated by the sequence itself. Fragment behavior indicates that it has an unusually compact configuration; we propose that this molecule contains a region of systematically bent B-DNA. This model accounts for the fragment's difficulty in snaking through the pores of a polyacrylamide gel, its ease in diffusing into Sephacryl beads, and its smaller rotational relaxation time. Bending of this molecule may be caused by periodicities in the DNA sequence.

A new purification procedure for Escherichia coli DNA polymerase yields about 10 mg of homogeneous enzyme per kg of cell paste, with exonuclease III as a by-product. DNA polymerase consists of a single polypeptide chain of molecular weight 1.09 × 105. This tentative conclusion is based on (a) an unchanged molecular weight after unfolding in solutions containing guanidine hydrochloride and mercaptoethanol, (b) the presence of approximately one residue of NH2-terminal methionine, and (c) the presence of a single zone on polyacrylamide gel electrophoresis in a denaturing solvent at several pH values. The enzyme contains one disulfide bond and a single reactive sulfhydryl group, which can be modified by iodoacetic acid without change in either polymerase or its associated exonuclease activity. There is less than one phosphorus atom per molecule, thus minimizing the possibility of enzyme-associated nucleotide material in stoichiometric amounts.

RNA interference is a powerful method for inhibition of gene expression in Trypanosoma brucei(Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K., and Ullu, E. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14687–14692). Here we describe a vector (pZJM) for in vivo tetracycline-inducible synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) in stably transformed cells. The dsRNA is synthesized from opposing T7 promoters. We tested the vector with genes involved in processes such as kinetoplast DNA replication, mitochondrial mRNA synthesis, glycosyl phosphatidylinositol biosynthesis, glycosome biogenesis, and polyamine biosynthesis. In most cases the induction of dsRNA caused specific and dramatic loss of the appropriate mRNA, and in many cases there was growth inhibition or cell death. One striking phenotype was the loss of kinetoplast DNA after interference with expression of a topoisomerase II. The gene being analyzed by this procedure need not even be fully sequenced. In fact, many of the genes we tested were derived from partial sequences in the T. brucei genome data base that were identified by homology with known proteins. It takes as little as 3 weeks from identification of a gene sequence in the data base to the appearance of a phenotype. RNA interference is a powerful method for inhibition of gene expression in Trypanosoma brucei(Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K., and Ullu, E. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14687–14692). Here we describe a vector (pZJM) for in vivo tetracycline-inducible synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) in stably transformed cells. The dsRNA is synthesized from opposing T7 promoters. We tested the vector with genes involved in processes such as kinetoplast DNA replication, mitochondrial mRNA synthesis, glycosyl phosphatidylinositol biosynthesis, glycosome biogenesis, and polyamine biosynthesis. In most cases the induction of dsRNA caused specific and dramatic loss of the appropriate mRNA, and in many cases there was growth inhibition or cell death. One striking phenotype was the loss of kinetoplast DNA after interference with expression of a topoisomerase II. The gene being analyzed by this procedure need not even be fully sequenced. In fact, many of the genes we tested were derived from partial sequences in the T. brucei genome data base that were identified by homology with known proteins. It takes as little as 3 weeks from identification of a gene sequence in the data base to the appearance of a phenotype. RNA interference kinetoplast DNA universal minicircle sequence-binding protein topoisomerase II structure-specific endonuclease I DNA polymerase β ornithine decarboxylase double-stranded RNA polymerase chain reaction base pair(s) kilobase(s) Trypanosoma brucei is the protozoan parasite that causes sleeping sickness, a fatal disease that currently affects several hundred thousand people in sub-Saharan Africa. Closely related parasites, Trypanosoma cruzi and Leishmania, are also significant pathogens in tropical countries. In addition to their major impact on human health, these parasites have been important subjects for the study of a number of significant basic biological processes, including RNA editing, glycosyl phosphatidylinositol (GPI) anchoring, and antigenic variation. However, many questions concerning the virulence and general biology of these fascinating parasites remain to be answered. These problems are sometimes difficult to address because trypanosomes are diploid and the available genetic tools are labor intensive. RNA interference (RNAi)1 is a recently discovered process in which the introduction of a double-stranded RNA into a cell causes specific degradation of an mRNA containing the same sequence (reviewed in Ref. 1Bass B.L. Cell. 2000; 101: 235-238Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (340) Google Scholar). Specific loss of gene expression by RNAi has been shown to occur in a variety of organisms including Caenorhabditis elegans (2Fire A. Xu S. Montgomery M.K. Kostas S.A. Driver S.E. Mello C.C. Nature. 1998; 391: 806-811Crossref PubMed Scopus (11908) Google Scholar), T. brucei (3Ngo H. Tschudi C. Gull K. Ullu E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 14687-14692Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar), plants (4Waterhouse P.M. Graham M.W. Wang M.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 13959-13964Crossref PubMed Scopus (914) Google Scholar), Neurospora (5Cogoni C. Irelan J.T. Schumacher M. Schmidhauser T.J. Selker E.U. Macino G. EMBO J. 1996; 15: 3153-3163Crossref PubMed Scopus (299) Google Scholar),Drosophila (6Kennerdell J.R. Carthew R.W. Cell. 1998; 95: 1017-1026Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (948) Google Scholar), planaria (7Sanchez Alvarado A. Newmark P.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 5049-5054Crossref PubMed Scopus (449) Google Scholar), mouse embryos (8Wianny F. Zernicka-Goetz M. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 70-75Crossref PubMed Scopus (620) Google Scholar), and zebrafish (9Li Y.X. Farrell M.J. Liu R. Mohanty N. Kirby M.L. Dev. Biol. 2000; 217: 394-405Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar). Several genes involved in the RNAi mechanism have been described (10Tabara H. Sarkissian M. Kelly W.G. Fleenor J. Grishok A. Timmons L. Fire A. Mello C.C. Cell. 1999; 99: 123-132Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1014) Google Scholar, 11Ketting R.F. Haverkamp T.H. van Luenen H.G. Plasterk R.H. Cell. 1999; 99: 133-141Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (605) Google Scholar, 12Cogoni C. Macino G. Science. 1999; 286: 2342-2344Crossref PubMed Scopus (221) Google Scholar, 13Cogoni C. Macino G. Nature. 1999; 399: 166-169Crossref PubMed Scopus (521) Google Scholar), and insights into the molecular mechanism of this process have recently been published (14Grishok A. Tabara H. Mello C.C. Science. 2000; 287: 2494-2497Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar, 15Zamore P.D. Tuschl T. Sharp P.A. Bartel D.P. Cell. 2000; 101: 25-33Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). As suggested by Ullu and co-workers (3Ngo H. Tschudi C. Gull K. Ullu E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 14687-14692Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar), RNAi could be a powerful tool to genetically manipulate trypanosomes. One advantage of RNAi over conventional gene knockout approaches is that only a few hundred base pairs of a gene sequence is required. This feature is noteworthy because the T. brucei genome project is rapidly moving forward and currently there are at least partial sequences available for most of the genes of the parasite. RNAi in T. brucei was first achieved in transient fashion by electroporation of in vitro synthesized dsRNA (3Ngo H. Tschudi C. Gull K. Ullu E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 14687-14692Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar). A more valuable approach utilizing inducible, stably maintained constructs that express stem-loop transcripts has recently been described (16Shi H. Djikeng A. Mark T. Wirtz E. Tschudi C. Ullu E. RNA. 2000; 6: 1069-1076Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar, 17Bastin P. Ellis K. Kohl L. Gull K. J. Cell Sci. 2000; 113: 3321-3328Crossref PubMed Google Scholar). These integrated constructs are heritable and provide for prolonged expression of dsRNA, allowing interference of expression of genes of highly stable proteins. We have now designed a vector (pZJM) in which a PCR-amplified gene fragment is ligated in a single step between opposing T7 promoters (18Timmons L. Fire A. Nature. 1998; 395: 854Crossref PubMed Scopus (1441) Google Scholar). pZJM also incorporates features of the powerful tetracycline-inducible promoters in vectors developed by Wirtz et al. (19Wirtz E. Hoek M. Cross G.A. Nucleic Acids Res. 1998; 26: 4626-4634Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Integration of pZJM into a nontranscribed region of theT. brucei genome results in establishment of a stable cell line (20Wirtz E. Clayton C. Science. 1995; 268: 1179-1183Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar). Tetracycline induction then leads to the production of dsRNA with concomitant degradation of the target mRNA. We have assessed the effectiveness of this vector in targeting a wide variety ofT. brucei genes. Given its relative ease of use and effectiveness, pZJM should prove to be a valuable tool in evaluating gene function in trypanosomes. Two vectors for RNAi were constructed by modifying pLew100 (a generous gift from Drs. Elizabeth Wirtz and George Cross, Rockefeller University (21Wirtz E. Leal S. Ochatt C. Cross G.A. Mol. Biochem. Parasitol. 1999; 99: 89-101Crossref PubMed Scopus (1126) Google Scholar)). The first vector is similar to that recently published by Shi et al. (16Shi H. Djikeng A. Mark T. Wirtz E. Tschudi C. Ullu E. RNA. 2000; 6: 1069-1076Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar) (see Fig. 1 A) and produces dsRNA as a stem-loop structure. The vector was constructed as follows. First, a ∼ 500-bp fragment of the gene of interest (target gene) was amplified by PCR from T. brucei 427 DNA using primers containing XbaI andHindIII linkers. This product was ligated into theNheI/HindIII sites of pJM326 (a gift from Dr. Stephen Gould, Johns Hopkins University (22Schrader M. Reuber B.E. Morrell J.C. Jimenez-Sanchez G. Obie C. Stroh T.A. Valle D. Schroer T.A. Gould S.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29607-29614Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (217) Google Scholar)). This plasmid carried the gene for an irrelevant Myc-tagged human protein (Pex 11 β), part of which will form the loop of the stem-loop transcript. This construct was then digested with HindIII and XbaI, liberating a ∼1050-bp fragment containing the target gene fused to the 3′ terminus of the Pex 11 β/Myc tag construct. The vector pLew100 was then digested with MluI andXbaI, releasing the luciferase reporter. The same region of the target gene as used above was amplified by PCR with MluI and XbaI linkers, followed by ligation into pLew100. Finally, the modified pLew100 was cut with XbaI andHindIII, and the ∼1050-bp target gene/Pex 11 β/myc tag fragment was ligated into the vector. The resultant plasmid contains two copies of the target gene fragment in opposite orientation separated by a ∼550-bp irrelevant stuffer region. Transcription from the tetracycline-inducible procyclin promoter yields an RNA that can fold into a stem-loop structure. The pZJM vector (see Fig. 1 B) was constructed as follows. Dual T7 terminators were amplified by PCR from pLew82 (19Wirtz E. Hoek M. Cross G.A. Nucleic Acids Res. 1998; 26: 4626-4634Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar) using primers containing KpnI and NheI linkers (the primers were GGTACCCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA and GCTAGCCCGCTGAGCAATAACTAGCATAACC), and the 230-bp product was cloned into pCR-TOPO (Invitrogen, Carlsbad CA). A 71-bp fragment containing the T7 promoter/Tet operator was amplified from pLew82 using primers with NheI and XhoI linkers (the primers were GCTAGCACCTGATTAATACGACTCACT and CTCGAGGGGCTAGATCTCTATCACTG). This fragment was then ligated into the NheI and XhoI sites of the T7 terminator construct generated above. The T7 terminator/promoter cassette was then ligated into the KpnI and XhoI sites of pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla CA). A 650-bp fragment of the T. brucei α-tubulin gene was amplified by PCR with primers containing XhoI andHindIII linkers (the primers were CACCTCGAGATGCGTGAGGCTATCTGCATC and CACAAGCTTAGGTTGCGGCGAGTCAAATC). The product was then ligated into the XhoI andHindIII sites of the modified pBluescript SK+ described above. A second T7 terminator/promoter cassette was generated by PCR of the original cassette using primers with BamHI andPstI linkers (the primers were GGATCCCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA and CTGCAGGGGCTAGATCTCTATCACTG). The product was then ligated into the modified pBluescript SK+ that contains the tubulin/T7 terminator/promoter cassette. This pBluescript SK+ construct contains two opposing T7 terminator/promoter cassettes separated by a 650-bp tubulin gene fragment. To generate pZJM, theKpnI-BamHI fragment was ligated into pLew100, replacing the luciferase gene. The tubulin fragment was included to prevent the formation of cruciform structures. To insert a gene fragment into pZJM for transfection into the parasite, a 250–600-bp fragment of the coding region of the target was amplified by 30 cycles of PCR, with an annealing temperature of 55 °C using 50 ng of T. brucei 427 genomic DNA as template. The PCR primers contained XhoI and HindIII linkers. The PCR products were then ligated into pZJM, replacing the tubulin stuffer. Procyclic T. brucei strain 29–13 (also a gift from Drs. Elizabeth Wirtz and George Cross), which harbors integrated genes for T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor, were grown in SDM-79 supplemented with 15% fetal bovine serum (21Wirtz E. Leal S. Ochatt C. Cross G.A. Mol. Biochem. Parasitol. 1999; 99: 89-101Crossref PubMed Scopus (1126) Google Scholar). Parasites were cultured in the presence of G418 (15 μg/ml) and hygromycin (50 μg/ml) to maintain the T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor constructs, respectively. For transfection, cells (1 × 108) were washed once in 5 ml of cytomix (23van den Hoff M.J. Moorman A.F. Lamers W.H. Nucleic Acids Res. 1992; 20: 2902Crossref PubMed Scopus (385) Google Scholar) and resuspended in 0.5 ml of cytomix containing 10 μg of plasmid that had been linearized with EcoRV (stem-loop construct) or NotI (pZJM) so that it could target the rDNA spacer region (20Wirtz E. Clayton C. Science. 1995; 268: 1179-1183Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar). Transfections were carried out in 2-mm cuvettes using a BTX electroporator with peak discharge at 1.6 kV in resistance timing mode R2 (24 ohms). Immediately following transfection, cells were transferred into 10 ml of SDM-79 supplemented with G418 and hygromycin. After 1 day, selection was applied by culturing in the presence of 2.5 μg/ml phleomycin, and the cells were grown for 2 weeks to form stable lines. The cells were not cloned. For induction of dsRNA, cells were cultured in the above medium containing 1.0 μg/ml tetracycline. Cells were diluted 10-fold when densities reached a minimum of 1 × 106 cells/ml. They were not allowed to grow beyond 5 × 106 cells/ml before diluting again. Cell densities were determined using a Coulter counter model Z1 (Coulter Electronics) and plotted on the growth curves as the product of the cell density and the total dilution. Total RNA was purified from 5 × 107 parasites (Purescript RNA Isolation Kit, Gentra Systems) and electrophoresed on formaldehyde-1.5% agarose gels. Ribosomal RNA levels were estimated by ethidium bromide staining to ensure equal amounts of total RNA were loaded in each lane. The RNA was then transferred to GeneScreen Plus transfer membrane (PerkinElmer Life Sciences). 32P-Labeled probes were made by random priming the same PCR products used as inserts in either the stem-loop or the pZJM vector. Hybridization was carried out overnight at 42 °C in 50% formamide, 5× SSC, 10% dextran sulfate, 1% SDS, 1× Denhardt's solution, 0.2 mg/ml salmon sperm DNA. Blots were washed twice for 5 min in 0.1× SSC, 0.1% SDS at 56 °C. The percentage of reduction of mRNA levels induced by RNAi was estimated by densitometry of appropriately exposed autoradiograms. Proteins from 2.5 × 106cell equivalents were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (15% gel), transferred onto Immobilon P, and probed using mouse IgG polyclonal antibodies raised against Crithidia fasciculata universal minicircle sequence-binding protein (UMSBP). The antibody was a generous gift of Dr. Joseph Shlomai (Hebrew University). Primary antibodies were detected with secondary rabbit anti-mouse IgG conjugated to alkaline phosphatase and then developed with NBT/BCIP. Using this vector (Fig. 1 A), we tested sequences encoding parts of a topo II (24Strauss P.R. Wang J.C. Mol. Biochem. Parasitol. 1990; 38: 141-150Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar) and a candidate mitochondrial RNA polymerase. The entire open reading frame of topo II had been cloned, whereas the RNA polymerase was identified in the TIGR database by searching for sequences homologous to a mammalian mitochondrial RNA polymerase. We selected stable transfectants, induced expression of dsRNA and then monitored the effects of dsRNA production on steady-state mRNA levels and cell growth. In the case of topo II (Fig. 2), Northern analysis revealed a ∼90% reduction of its mRNA 24 h after induction with tetracycline. Cells stopped growing eight days after induction (Table I and Fig. 2). Interestingly, the kDNA of these cells, visualized by DAPI staining, became gradually smaller until the cells became dyskinetoplastic (not shown) and died (Table I). We are now conducting a detailed study of the mechanism of this loss of kDNA. Expression of the mitochondrial RNA polymerase dsRNA led to a ∼95% reduction of its mRNA after 24 h of induction, with growth inhibition 6 days after induction (Fig. 2). This inhibition was followed by cell death (Table I).Table IRNAi of different genesRNAi target 1-aReferences or GenBank™ accession numbers are: Topo II (24), RNA pol (AQ653994), p34/p37 (33), GPI 10 (28), Pex 11 (30), UMSBP (AQ952609), CDC47 (AF164200), RNase HI (U74470), Pol β (AQ948642), SSE1 (AQ650584), and ODC (31). Those with references have been cloned in T. brucei, and those with accession numbers were obtained from the T. brucei genomic data base at TIGR.Proposed functionFragment size 1-bFragment size of target gene. This information, plus the end sequence, defines the fragment used.End sequence of fragmentRNAi vectorLoss of mRNA 1-cDetermined by densitometry of northern blots of total RNA isolated after 24 h for cells transfected with the stem-loop vector and after 40 h for cells transfected with pZJM (except for pol β mRNA, which was collected after 33 h).Phenotype 1-dSee text for timing of appearance of phenotype.bp%Topo IIkDNA replication 1-eThe proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.584TAGGCTTTCA …stem-loop∼90Dyskinetoplasty, cell deathRNA polRNA synthesis 1-fThe proposed function is based on homology to mammalian or yeast proteins.467CCCATTATGA …stem-loop∼95Cell deathTopo IIkDNA replication1-eThe proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.584TAGGCTTTCA …pZJM∼80Dyskinetoplasty, cell deathGPI 10GPI biosynthesis 1-gThe proposed function is based on activity of authentic T. brucei protein.498GTTATGGGTT …pZJM∼50None observedPex 11Glycosome biogenesis1-gThe proposed function is based on activity of authentic T. brucei protein.498GCCGCGACAA …pZJM∼93Cell deathp34/p37 1-hBoth p34 and p37 are targeted for RNAi by this construct.RNA binding1-gThe proposed function is based on activity of authentic T. brucei protein.501ACGCCACAAG …pZJM∼95Growth inhibition, some multinucleateUMSBPkDNA replication1-eThe proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.285GCCCGCACAT …pZJM∼80Growth inhibition, some anucleateCDC47Nuclear DNA replication1-fThe proposed function is based on homology to mammalian or yeast proteins.499GATCGTGATT …pZJM∼80None observedRNase H1RNA metabolism1-eThe proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.501CCTATGCTAG …pZJMNo changeNone observedPol βkDNA replication1-eThe proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.527GGCAGACCAG …pZJM∼55None observedTopo II/pol βkDNA replication1-eThe proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.584/527pZJM∼82/93Dyskinetoplasty, cell deathSSE1kDNA replication1-eThe proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.500TAGGACAGTC …pZJM∼351-iThis value has very low accuracy because the SSE1 mRNA appeared to have received only limited cleavages after induction of RNAi (see Northern blot in Fig. 4).Enlarged kDNA, cell deathODCPolyamine biosynthesis1-gThe proposed function is based on activity of authentic T. brucei protein.500GGGGACATTG …pZJM∼98Putrescine-dependent growth1-a References or GenBank™ accession numbers are: Topo II (24Strauss P.R. Wang J.C. Mol. Biochem. Parasitol. 1990; 38: 141-150Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar), RNA pol (AQ653994), p34/p37 (33Zhang J. Williams N. Mol. Biochem. Parasitol. 1997; 87: 145-158Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar), GPI 10 (28), Pex 11 (30), UMSBP (AQ952609), CDC47 (AF164200), RNase HI (U74470), Pol β (AQ948642), SSE1 (AQ650584), and ODC (31Phillips M.A. Coffino P. Wang C.C. J. Biol. Chem. 1987; 262: 8721-8727Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Those with references have been cloned in T. brucei, and those with accession numbers were obtained from the T. brucei genomic data base at TIGR.1-b Fragment size of target gene. This information, plus the end sequence, defines the fragment used.1-c Determined by densitometry of northern blots of total RNA isolated after 24 h for cells transfected with the stem-loop vector and after 40 h for cells transfected with pZJM (except for pol β mRNA, which was collected after 33 h).1-d See text for timing of appearance of phenotype.1-e The proposed function is based on activity of homologous protein from C. fasciculata.1-f The proposed function is based on homology to mammalian or yeast proteins.1-g The proposed function is based on activity of authentic T. brucei protein.1-h Both p34 and p37 are targeted for RNAi by this construct.1-i This value has very low accuracy because the SSE1 mRNA appeared to have received only limited cleavages after induction of RNAi (see Northern blot in Fig. 4). Open table in a new tab To avoid the time-consuming introduction of inserts into the stem-loop vector, we constructed pZJM, a vector that allows PCR-generated fragments of any target gene to be inserted between opposing tetracycline-inducible T7 promoters (Fig. 1 B). In an initial characterization of this vector, we attempted to generate FAT cells, a swollen cell phenotype described previously for RNAi of the α-tubulin gene (3Ngo H. Tschudi C. Gull K. Ullu E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 14687-14692Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar, 16Shi H. Djikeng A. Mark T. Wirtz E. Tschudi C. Ullu E. RNA. 2000; 6: 1069-1076Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar). With a fragment of the α−tubulin gene in the cloning site of pZJM, we transfected procyclic forms of T. brucei. Following the generation of stable transfectants, we induced with tetracycline and after 1 day FAT cells were evident, comparable with previous results (16Shi H. Djikeng A. Mark T. Wirtz E. Tschudi C. Ullu E. RNA. 2000; 6: 1069-1076Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar). To further characterize pZJM, we tested RNA interference of a number of other genes, including one homologous with UMSBP, a C. fasciculata protein that binds to the replication origin of kDNA minicircles (25Tzfati Y. Abeliovich H. Kapeller I. Shlomai J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 6891-6895Crossref PubMed Scopus (52) Google Scholar). After 40 h of tetracycline induction, UMSBP mRNA was reduced by ∼80%. In contrast, probing the same blot for mitochondrial pol β mRNA revealed no change in level after tetracycline induction (Fig. 3 A, bottom panel), confirming the specificity of RNAi. Although a substantial amount of UMSBP-specific dsRNA of the predicted size is detected in the tetracycline-induced lane, a small amount of the same species was detected in the uninduced culture (indicated by an asteriskin Fig. 3 A). Therefore, there is a low level of expression of dsRNA even in the absence of added tetracycline. Induction of dsRNA led to loss of detectable UMSBP protein after 10 days (Fig. 3 B). In another experiment, UMSBP protein levels were reduced by ∼32% after 1 day of induction and ∼75% after 3 days of induction (data not shown). Growth was slowed in the tetracycline-induced cells starting at about day 7. After 12 days of induction, 10–15% of the cells lacked nuclei, whereas less than 0.1% of the uninduced cells were anucleate. We then tested the pZJM system on genes involved in a number of biological processes, including kDNA replication (topo II (24Strauss P.R. Wang J.C. Mol. Biochem. Parasitol. 1990; 38: 141-150Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar)), SSE1 (homologous to C. fasciculata SSE1 (26Engel M.L. Ray D.S. Nucleic Acids Res. 1998; 26: 4733-4738Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar)), mitochondrial pol β (homologous to C. fasciculata mitochondrial pol β (27Torri A.F. Englund P.T. J. Biol. Chem. 1995; 270: 3495-3497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (62) Google Scholar))), GPI biosynthesis (GPI10 (28Nagamune K. Nozaki T. Maeda Y. Ohishi K. Fukuma T. Hara T. Schwarz R.T. Sutterlin C. Brun R. Riezman H. Kinoshita T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 10336-10341Crossref PubMed Scopus (155) Google Scholar)), nuclear replication (CDC47 (homologous to Saccharomyces cerevisiae CDC47 (29Dalton S. Whitbread L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 2514-2518Crossref PubMed Scopus (112) Google Scholar)), glycosome biogenesis (Pex 11 (30)), polyamine biosynthesis (ornithine decarboxylase (ODC) (31Phillips M.A. Coffino P. Wang C.C. J. Biol. Chem. 1987; 262: 8721-8727Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar)), RNA metabolism (RNase H1 (homologous toC. fasciculata RNase H1 (32Campbell A.G. Ray D.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 9350-9354Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar)), and p34/p37 (33Zhang J. Williams N. Mol. Biochem. Parasitol. 1997; 87: 145-158Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar)). The RNAi effect on growth kinetics and mRNA levels for all of these proteins is shown in Fig. 4, and the results are summarized in Table I. Using pZJM(topo II) to interfere with topo II expression, we were able to reduce its mRNA level by ∼80% at 40 h (Fig. 2). The growth rate of a culture expressing topo II dsRNA was similar to that with the stem-loop vector, with cell growth inhibited about 8 days after induction. Furthermore, expression of dsRNA from pZJM(topo II) led to dyskinetoplasty and cell death, as seen with the stem-loop construct (not shown). As was the case with UMSBP, a small amount of dsRNA was synthesized in uninduced cells (not shown), but this had little impact on cell growth. The doubling time of the uninduced cell line was 17.8 h compared with the doubling time of the parental cell line 29–13, which was 17.4 h (not shown). Furthermore, cells harboring pZJM(topo II) cultured for 2 months in the presence of phleomycin (to maintain the integration construct) grew normally. These cells retained the ability to express dsRNA upon induction and became dyskinetoplastic and died at rates similar to those seen with the original transfectants (not shown). These results indicate that the low level of topo II-specific dsRNA in uninduced cells does not have detectable deleterious effects. Table I summarizes the effects of dsRNA expression on cell growth and mRNA levels for the genes examined. RNA interference of p34/p37 (mRNA reduced ∼95%), SSE1 (mRNA reduced ∼35%), ODC (mRNA reduced ∼98%), and Pex 11 (mRNA reduced ∼93%) led to aberrant cell growth after 5–10 days (Fig. 4). Following induction of p34/p37 dsRNA, 20% of the parasites became multinucleate, whereas uninduced cells did not show this effect. In the case of SSE1, there appeared to be an enlargement of the kinetoplast after expression of dsRNA. On the other hand, RNA interference of other genes, including GPI10 (mRNA reduced ∼50%), CDC47 (mRNA reduced ∼80%), and pol β (mRNA reduced ∼55%), had little or no effect on trypanosome growth. pZJM(RNase H1)-transfected cells expressed dsRNA (not shown) which, in contrast to all the other genes studied, did not lead to a reduction of the targeted mRNA (Fig. 4). ODC converts ornithine to putrescine, a reaction in the polyamine biosynthetic pathway that is required for parasite growth (31Phillips M.A. Coffino P. Wang C.C. J. Biol. Chem. 1987; 262: 8721-8727Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Induction of ODC dsRNA led to a 98% reduction of mRNA level and inhibition of cell growth after 3 days (Table I and Fig. 4). Parasites lacking ODC because of conventional gene knockouts could not grow but persisted in an elongated, slender form for up to 8 weeks (34Li F. Hua S.B. Wang C.C. Gottesdiener K.M. Mol. Biochem. Parasitol. 1996; 78: 227-236Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). We found the same morphology in cells expressing ODC dsRNA (not shown). Furthermore, like cells with the ODC genes knocked out (34Li F. Hua S.B. Wang C.C. Gottesdiener K.M. Mol. Biochem. Parasitol. 1996; 78: 227-236Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), the RNAi parasites could be rescued if putrescine was added to the growth medium (Fig. 5). Finally, cells that had been expressing ODC dsRNA for 13 days were rescued by removal of tetracycline, with recovery occurring after 2 days of growth in tetracycline-deficient medium (Fig. 5). The fact that cells deficient in ODC expression because of RNAi behave similarly to ODC knockout cells provides confidence in the reliability of RNAi for studyingT. brucei gene expression. For this experiment we ligated a 584-bp fragment of topo II and a 527-bp fragment of pol β in tandem into pZJM. Expression of dsRNA from this construct led to the reduction of mRNA for both topo II and pol β (82% and 93%, respectively). The control mRNA level (UMSBP) was not altered (Fig. 6 A). These cells developed a growth defect and dyskinetoplasty similar to that found in cells transfected with pZJM(topo II) (Fig. 6 B). Traditional methods for generating genetic knockouts inT. brucei are time-consuming. In contrast, RNAi has been shown to be a much simpler and faster method for selective interference of gene expression (3Ngo H. Tschudi C. Gull K. Ullu E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 14687-14692Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar, 16Shi H. Djikeng A. Mark T. Wirtz E. Tschudi C. Ullu E. RNA. 2000; 6: 1069-1076Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar). Unlike gene knockouts in which each locus must be individually disrupted, RNAi can inhibit expression of multiple copies of a target gene. Furthermore, RNAi does not even require fully cloned genes, whereas traditional knockouts generally need at least the 5′- and 3′-flanking regions. This feature makes RNAi a powerful tool to assess the function of partially sequenced genes available in the rapidly expanding T. brucei genome data base. It was our objective to make a vector that could be stably integrated and easily used for the analysis of a variety of genes. pZJM uses opposing tetracycline-inducible T7 promoters flanking a partial sequence of the target gene, and it is integrated into a nontranscribed region of the genome of procyclic trypanosomes that express both the T7 polymerase and the tetracycline repressor (21Wirtz E. Leal S. Ochatt C. Cross G.A. Mol. Biochem. Parasitol. 1999; 99: 89-101Crossref PubMed Scopus (1126) Google Scholar). pZJM is simple to use because it requires only a single cloning step in which the target gene fragment is inserted between the two T7 promoters. The convenience of the pZJM method is emphasized by the fact that after identification of a candidate gene sequence in the data base it takes as little as 3 weeks to obtain results from induction of RNAi in a stable cell line. Both the stem-loop and pZJM vectors were effective in inducing the selective reduction of mRNA levels 24–40 h after induction with tetracycline. In many cases induction of RNAi resulted in a slowing or termination of cell growth, often followed by cell death. There was some variation in the effectiveness of interference of gene expression. For example, in the case of topo II with the stem-loop vector (Fig. 2) or with pZJM(topo II/pol β) (Fig. 5) reduction of the mRNA level was at least 90%. However, with pZJM(topo II) (Fig. 4) RNAi was less effective, with only about 80% reduction of mRNA level. In a different induction of the same pZJM(topo II) cell line, there was only a 70% reduction of topo II mRNA. In all cases, however, cell growth reduction and the timing of appearance of dyskinetoplasty were similar. With pZJM, different genes varied in their sensitivity to RNAi as judged by Northern blots (Fig. 4). In the cases of p34/p37, Pex 11, and ODC, the depletion of mRNA was nearly complete, and in all cases there was a striking effect on cell growth. In contrast, interference of expression of topo II, GPI10, and pol β had less severe effects on mRNA levels (Fig. 4 and Table I). In the latter two cases there was no effect on growth, either because the genes are not essential under our experimental conditions or because there is sufficient mRNA present after tetracycline induction to sustain normal cell growth. Again, pol β interference showed variation with different constructs. Using pZJM(pol β), mRNA reduction was 55% and using pZJM(topo II/pol β), it was 93%. It is worth noting that in one experiment using the stem-loop construct (not shown), pol β mRNA was depleted by 98%, and in that case the growth of the parasites was affected. One reason for the differences could be that the cells are not clonal. RNase H1 mRNA was not reduced by expression of dsRNA (Fig. 4). This insensitivity to RNAi could be a consequence of rapid turnover of its mRNA. Alternatively, RNase H1 might play a heretofore unrecognized role in the RNAi mechanism so that its reduction would diminish the process of RNAi. As for phenotypes induced by RNAi, there is considerable variation with different genes in the rate of appearance of the growth effects, and this variation is probably due to differences in the turnover kinetics of both the mRNA and the protein product. dsRNA is detected several hours after the addition of tetracycline (16Shi H. Djikeng A. Mark T. Wirtz E. Tschudi C. Ullu E. RNA. 2000; 6: 1069-1076Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar), 2Z. Wang, J. C. Morris, M. E. Drew, and P. T. Englund, unpublished observations. and in most cases a large fraction of the mRNA is degraded within 40 h (Table I and Fig. 4). After depletion of mRNA, the appearance of a phenotype must depend on the abundance and the stability of the protein. For example, UMSBP mRNA was depleted by 80% after 40 h of dsRNA induction, and after 3 days protein levels dropped 75%. The growth phenotype only became convincing after 10 days of induction, when the protein was undetectable by Western blotting (Fig. 3). Some phenotypes, such as the appearance of anucleate cells after interference with UMSBP expression and multinucleate cells after blocking p34/p37 expression, are complex and have not yet been studied further. We consistently detected a small amount of dsRNA expressed from the pZJM vector in the absence of added tetracycline. This did not appear to be the case with the stem-loop vector, which uses the procyclin promoter (Fig. 1), because even with long exposures of the autoradiograms there was no detectable dsRNA in any of the uninduced cells. In all of the genes tested, this uninduced transcription had little or no detectable effect on the growth of the cells. In the case of pZJM(topo II), uninduced cells grew normally for over 2 months and, upon induction, exhibited the same phenotype as that of newly transfected strains. We have shown that pZJM can be used to analyze a large number of genes quickly (Fig. 4), and it can also be used to study two genes simultaneously (Fig. 5). We are currently generating a pZJM-based library of genomic fragments that should allow the use of "forward genetics" to discover genes responsible for interesting phenotypes. Zefeng Wang especially thanks Elisabetta Ullu and Chris Tschudi for introducing him to the study of RNAi in T. brucei at the Biology of Parasitism course at Woods Hole and for providing continuing valuable advice. We also thank Andy Fire for important suggestions. We thank Barbara Sollner-Webb, Vern Carruthers, Michele Klingbeil, Kim Paul, and Tina Saxowsky for valuable comments on the manuscript. Viiu Klein provided outstanding technical support.

Using kinetoplast DNA networks as a substrate in a decatenation assay, we have purified to apparent homogeneity a type I1 DNA topoisomerase from HeLa cell nuclei.The most pure preparations contain a single polypeptide of 172,000 daltons as determined by sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis.The molecular weight of the native protein, based on sedimentation and gel filtration analyses, is estimated to be 309,000.These results suggest that the enzyme is a dimer of 172,000-dalton subunits.The enzyme is a type I1 topoisomerase as demonstrated by its ability to change the linking number of DNA circles in steps of two and to decatenate or unknot covalently closed DNA circles.No gyrase activity is detectable.ATP is required for the relaxation, decatenation, and unknotting of DNA, and a DNA-dependent ATPase activity is present in the most pure fractions.ATP is hydrolyzed to ADP in this reaction.This enzyme is very similar in its catalytic properties to T4 DNA topoisomerase (Liu, L. F., Liu, C.

Abstract The Escherichia coli DNA polymerase, in the absence of DNA, contains a single binding site for which all the deoxyribonucleoside 5'-triphosphates complete. Dissociation constants of the enzyme-triphosphate complexes range from 1 x 10-5 to 2 x 10-4 m. Various analogues of the deoxyribonucleoside 5'-triphosphates also bind to the same site on DNA polymerase. The principal structural requirement for detectable binding at this site appears to be possession of a triphosphate group. Binding of triphosphates is inhibited when the concentration of potassium phosphate is increased, and is inhibited, but to a lesser extent, by increasing potassium chloride concentration. In addition, binding is abolished in the absence of Mg++ and in the presence of 9 mm EDTA. The strength of binding decreases with increasing temperature. Binding measurements were made with equilibrium dialysis microcells, which require only 20 µl of protein solution and in which equilibrium with triphosphates is attained within 90 min at 22°.