Chromosomal aneuploidy is the major reason why couples opt for prenatal diagnosis. Current methods for definitive diagnosis rely on invasive procedures, such as chorionic villus sampling and amniocentesis, and are associated with a risk of fetal miscarriage. Fetal DNA has been found in maternal plasma but exists as a minor fraction among a high background of maternal DNA. Hence, quantitative perturbations caused by an aneuploid chromosome in the fetal genome to the overall representation of sequences from that chromosome in maternal plasma would be small. Even with highly precise single molecule counting methods such as digital PCR, a large number of DNA molecules and hence maternal plasma volume would need to be analyzed to achieve the necessary analytical precision. Here we reasoned that instead of using approaches that target specific gene loci, the use of a locus-independent method would greatly increase the number of target molecules from the aneuploid chromosome that could be analyzed within the same fixed volume of plasma. Hence, we used massively parallel genomic sequencing to quantify maternal plasma DNA sequences for the noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 21. Twenty-eight first and second trimester maternal plasma samples were tested. All 14 trisomy 21 fetuses and 14 euploid fetuses were correctly identified. Massively parallel plasma DNA sequencing represents a new approach that is potentially applicable to all pregnancies for the noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidies.

To validate the clinical efficacy and practical feasibility of massively parallel maternal plasma DNA sequencing to screen for fetal trisomy 21 among high risk pregnancies clinically indicated for amniocentesis or chorionic villus sampling.Diagnostic accuracy validated against full karyotyping, using prospectively collected or archived maternal plasma samples.Prenatal diagnostic units in Hong Kong, United Kingdom, and the Netherlands.753 pregnant women at high risk for fetal trisomy 21 who underwent definitive diagnosis by full karyotyping, of whom 86 had a fetus with trisomy 21. Intervention Multiplexed massively parallel sequencing of DNA molecules in maternal plasma according to two protocols with different levels of sample throughput: 2-plex and 8-plex sequencing.Proportion of DNA molecules that originated from chromosome 21. A trisomy 21 fetus was diagnosed when the z score for the proportion of chromosome 21 DNA molecules was >3. Diagnostic sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were calculated for trisomy 21 detection.Results were available from 753 pregnancies with the 8-plex sequencing protocol and from 314 pregnancies with the 2-plex protocol. The performance of the 2-plex protocol was superior to that of the 8-plex protocol. With the 2-plex protocol, trisomy 21 fetuses were detected at 100% sensitivity and 97.9% specificity, which resulted in a positive predictive value of 96.6% and negative predictive value of 100%. The 8-plex protocol detected 79.1% of the trisomy 21 fetuses and 98.9% specificity, giving a positive predictive value of 91.9% and negative predictive value of 96.9%.Multiplexed maternal plasma DNA sequencing analysis could be used to rule out fetal trisomy 21 among high risk pregnancies. If referrals for amniocentesis or chorionic villus sampling were based on the sequencing test results, about 98% of the invasive diagnostic procedures could be avoided.

Significance Plasma consists of DNA released from multiple tissues within the body. Using genome-wide bisulfite sequencing of plasma DNA, we obtained a bird’s eye view of the identities and contributions of these tissues to the circulating DNA pool. The tissue contributors and their relative proportions are identified by a bioinformatics deconvolution process that draws reference from DNA methylation signatures representative of each tissue type. We validated this approach in pregnant women, cancer patients, and transplant recipients. This method also allows one to identify the tissue of origin of genomic aberrations observed in plasma DNA. This approach has numerous research and diagnostic applications in prenatal testing, oncology, transplantation monitoring, and other fields.

Significance We used massively parallel sequencing to study the size profiles of plasma DNA samples at single-base resolution and in a genome-wide manner. We used chromosome arm-level z -score analysis (CAZA) to identify tumor-derived plasma DNA for studying their specific size profiles. We showed that populations of aberrantly short and long DNA molecules existed in the plasma of patients with hepatocellular carcinoma. The short ones preferentially carried the tumor-associated copy number aberrations. We further showed that there were elevated amounts of mitochondrial DNA in the plasma of hepatocellular carcinoma patients. Such molecules were much shorter than the nuclear DNA in plasma. These findings have shed light on fundamental biological characteristics of plasma DNA and related diagnostic applications for cancer.

Circulating cell-free Epstein–Barr virus (EBV) DNA is a biomarker for nasopharyngeal carcinoma. We conducted a prospective study to investigate whether EBV DNA in plasma samples would be useful to screen for early nasopharyngeal carcinoma in asymptomatic persons.

The discovery of fetal DNA in maternal plasma has opened up an approach for noninvasive prenatal diagnosis. Despite the rapid expansion in clinical applications, the molecular characteristics of plasma DNA in pregnant women remain unclear.We investigated the size distribution of plasma DNA in 34 nonpregnant women and 31 pregnant women, using a panel of quantitative PCR assays with different amplicon sizes targeting the leptin gene. We also determined the size distribution of fetal DNA in maternal plasma by targeting the SRY gene.The median percentages of plasma DNA with size >201 bp were 57% and 14% for pregnant and nonpregnant women, respectively (P <0.001, Mann-Whitney test). The median percentages of fetal-derived DNA with sizes >193 bp and >313 bp were 20% and 0%, respectively, in maternal plasma.Plasma DNA molecules are mainly short DNA fragments. The DNA fragments in the plasma of pregnant women are significantly longer than those in the plasma of nonpregnant women, and the maternal-derived DNA molecules are longer than the fetal-derived ones.

Abstract Background: The precise measurement of cell-free fetal DNA in maternal plasma facilitates noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidies and other applications. We tested the hypothesis that microfluidics digital PCR, in which individual fetal-DNA molecules are counted, could enhance the precision of measuring circulating fetal DNA. Methods: We first determined whether microfluidics digital PCR, real-time PCR, and mass spectrometry produced different estimates of male-DNA concentrations in artificial mixtures of male and female DNA. We then focused on comparing the imprecision of microfluidics digital PCR with that of a well-established nondigital PCR assay for measuring male fetal DNA in maternal plasma. Results: Of the tested platforms, microfluidics digital PCR demonstrated the least quantitative bias for measuring the fractional concentration of male DNA. This assay had a lower imprecision and higher clinical sensitivity compared with nondigital real-time PCR. With the ZFY/ZFX assay on the microfluidics digital PCR platform, the median fractional concentration of fetal DNA in maternal plasma was ≥2 times higher for all 3 trimesters of pregnancy than previously reported. Conclusions: Microfluidics digital PCR represents an improvement over previous methods for quantifying fetal DNA in maternal plasma, enabling diagnostic and research applications requiring precise quantification. This approach may also impact other diagnostic applications of plasma nucleic acids, e.g., in oncology and transplantation.

Significance Genome-wide hypomethylation is frequently observed in cancers. In this study, we showed that genome-wide hypomethylation analysis in plasma using shotgun massively parallel bisulfite sequencing is a powerful general approach for the detection of multiple types of cancers. This approach is particularly attractive because high sensitivity and specificity can be achieved using low sequence depth, which is practical diagnostically. This approach can also be used for monitoring patients following treatment. The same sequencing data can be further used for detecting cancer-associated copy number aberrations at no additional costs. One could thus combine plasma hypomethylation and copy number analyses in a synergistic manner for further enhancing detection sensitivity or specificity.

To evaluate the effect of combining circulating Epstein-Barr viral (EBV) DNA load data with TNM staging data in pretherapy prognostication of nasopharyngeal carcinoma (NPC).Three hundred seventy-six patients with all stages of NPC were studied. Pretreatment plasma/serum EBV DNA concentrations were quantified by a polymerase chain reaction assay. Determinants of overall survival were assessed by multivariate analysis. Survival probabilities of patient groups, segregated by clinical stage (I, II, III, or IV) alone and also according to EBV DNA load (low or high), were compared.Pretherapy circulating EBV DNA load is an independent prognostic factor for overall survival in NPC. Patients with early-stage disease were segregated by EBV DNA levels into a poor-risk subgroup with survival similar to that of stage III disease and a good-risk subgroup with survival similar to stage I disease.Pretherapy circulating EBV DNA load is an independent prognostic factor to International Union Against Cancer (UICC) staging in NPC. Combined interpretation of EBV DNA data with UICC staging data leads to alteration of risk definition of patient subsets, with improved risk discrimination in early-stage disease. Validation studies are awaited.

Purpose This multinational study evaluated the antitumor activity of nivolumab in nasopharyngeal carcinoma (NPC). Tumor and plasma-based biomarkers were investigated in an exploratory analysis. Patients and Methods Patients with multiply pretreated recurrent or metastatic NPC were treated with nivolumab until disease progression. The primary end point was objective response rate (ORR) and secondary end points included survival and toxicity. The expression of programmed death-ligand 1 (PD-L1) and human leukocyte antigens A and B in archived tumors and plasma clearance of Epstein-Barr virus DNA were correlated with ORR and survival. Results A total of 44 patients were evaluated and the overall ORR was 20.5% (complete response, n = 1; partial response, n = 8). Nine patients received nivolumab for > 12 months (20%). The 1-year overall survival rate was 59% (95% CI, 44.3% to 78.5%) and 1-year progression-free survival (PFS) rate was 19.3% (95% CI, 10.1% to 37.2%). There was no statistical correlation between ORR and the biomarkers; however, a descriptive analysis showed that the proportion of patients who responded was higher among those with PD-L1 positive tumors (> 1% expression) than those with PD-L1-negative tumors. The loss of expression of one or both human leukocyte antigen class 1 proteins was associated with better PFS than when both proteins were expressed (1-year PFS, 30.9% v 5.6%; log-rank P = .01). There was no association between survival and PD-L1 expression or plasma Epstein-Barr virus DNA clearance. There was no unexpected toxicity to nivolumab. Conclusion Nivolumab has promising activity in NPC and the 1-year overall survival rate compares favorably with historic data in similar populations. Additional evaluation in a randomized setting is warranted. The biomarker results were hypothesis generating and validation in larger cohorts is needed.