Tumor-promoting phorbol esters such as 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) directly activate in vitro Ca2+-activated, phospholipid-dependent protein kinase (protein kinase C), which normally requires unsaturated diacylglycerol. Kinetic analysis indicates that TPA can substitute for diacylglycerol and greatly increases the affinity of the enzyme for Ca2+ as well as for phospholipid. Under physiological conditions, the activation of this enzyme appears to be linked to the receptor-mediated phosphatidylinositol breakdown which may be provoked by a wide variety of extracellular messengers, eventually leading to the activation of specific cellular functions or proliferation. Using human platelets as a model system, TPA is shown to enhance the protein kinase C-specific phosphorylation associated with the release reaction in the total absence of phosphatidylinositol breakdown. Various phorbol derivatives which have been shown to be active in tumor promotion are also capable of activating this protein kinase in in vitro systems.

Since the second messenger role was proposed for the products of inositol phospholipid hydrolysis, considerable progress has been made in our understanding of the biochemical mechanism of the intracellular signaling network. It is now becoming evident that stimulation of a cell surface receptor initiates a degradation cascade of various membrane lipid constituents. Many of their metabolites have potential to induce, intensify, and prolong the activation of protein kinase C that is needed for sustained cellular responses.

greatly stimulated by the addition of diacylglycerol at less than 5% (w/w) the concentration of phospholipid.This stimulation was due to an increase in the apparent affinity of enzyme for phospholipid and to a concomitant decrease in the KO value for Ca2+ from about 1 X M to the micromolar range.Diacylglycerol alone showed little or no effect on enzymatic activity over a wide range of Ca2+ concentrations.This effect was greatest for diacylglycerol which contained unsaturated fatty acid at least at position 2. The active diacylglycerols so far tested included diolein, dilinolein, diarachidonin, 1-stearoyl-2-oleoyl diglyceride, and 1stearoyl-2-linoleoyl diglyceride.In contrast, diacylglycerols containing saturated fatty acids such as dipalmitin and distearin were far less effective.Triacyl-and monoacylglycerols were totally ineffective, irrespective of the fatty acyl moieties.Cholesterol and free fatty acids were also ineffective.Based on these obsewations, a possible coupling is proposed between the protein kinase activation and phosphatidylinositol turnover which can be provoked by various extracellular messengers.

The proenzyme of a Ca2+-dependent protease-activated protein kinase previously obtained from mammalian tissues (Inoue, M., Kishimoto, A., Takai, Y., and Nishizuka, Y. (1977) J. Biol. Chem. 252, 7610-7616) was enzymatically fully active without limited proteolysis when Ca2+ and a membrane-associated factor were simultaneously present in the reaction mixture. The activation process was reversed by removing Ca2+ with ethylene glycol bis(beta-aminoethyl ether)N,N,N',N'-tetraacetic acid. An apparent Ka value for Ca2+ was less than 5 x 10(-5) M. Other divalent cations were inactive except for Sr2+, which was 5% as active as Ca2+. The factor was almost exclusively localized in membrane fractions of various tissues including brain, liver, kidney, skeletal muscle, blood cells, and adipose tissue. It was easily extractable with chloroform/methanol (2:1), and was recovered in the phospholipid fraction. In fact, this membrane factor could be replaced by chromatographically pure phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, or diphosphatidylglycerol. Phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and sphingomyelin were far less effective under the comparable conditions. Ca2+-dependent modulator protein was unable to support enzymatic activity. The enzyme thus activated showed an ability to phosphorylate five histone fractions and muscle phosphorylase kinase, and appeared to possess multifunctional catalytic activities.

in rat brain was investigated.Approximately one-third of the protein kinase was recovered in the soluble cytosol fraction, another one-third was in the crude mitochondrial fraction, and the rest was in nuclear and microsomal fractions.Upon further analysis of the crude mitochondrial fraction, most of the enzyme was found to be associated with synaptosomal membranes.The cytosol protein kinase was purified approximately 800- fold to apparent homogeneity by DEAE-cellulose and Sephadex G-150 column chromatographies, followed by isoelectrofocusing electrophoresis, blue-Sepharose CL-GB, and phenyl-Sepharose CG4B column chromatographies.The molecular weight of the protein kinase was about 77,000 as estimated by sucrose density gradient ultracentrifugation.The enzyme gave a single band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis with M, -82,000, indicating that the enzyme is composed of one polypeptide chain.The enzyme was free of calmodulin.The protein kinase associated with membrane was solubilized with Triton X-100, and partially purified by DEAE-cellulose and Sephadex G-150 column chromatographies.The membraneassociated protein kinase thus obtained was indistinguishable from the cytosol protein kinase in physical, kinetic, and catalytic properties.Both enzymes were fully activated by diacylglycerol in the presence of phospholipid and less than micromolar concentrations of Ca2+.

A tumor-promoting phorbol ester, [3H]phorbol-12,13-dibutyrate, may bind to a homogeneous preparation of Ca2+-activated, phospholipid-dependent protein kinase (protein kinase C) in the simultaneous presence of Ca2+ and phospholipid. This tumor promoter does not bind simply to phospholipid nor to the enzyme per se irrespective of the presence and absence of Ca2+. All four components mentioned above appear to be bound together, and the quaternary complex thus produced is enzymatically fully active for protein phosphorylation. Phosphatidylserine is most effective. Various other phorbol derivatives which are active in tumor promotion compete with [3H]phorbol-12,13-dibutyrate for the binding, and an apparent dissociation binding constant of the tumor promoter is 8 nM. This value is identical with the activation constant for protein kinase C and remarkably similar to the dissociation binding constant that is described for intact cell surface receptors. The binding of the phorbol ester is prevented specifically by the addition of diacylglycerol, which serves as activator of protein kinase C under physiological conditions. Scatchard analysis suggests that one molecule of the tumor promoter may bind to every molecule of protein kinase C in the presence of Ca2+ and excess phospholipid. It is suggestive that protein kinase C is a phorbol ester-receptive protein, and the results presented seem to provide clues for clarifying the mechanism of tumor promotion.

was found in the soluble fraction of rat brain.Upon limited proteolysis by calcium-dependent protease occurring in the same tissue, the proenzyme was converted to an active protein kinase which could phosphorylate five species of histone fractions.Trypsin also catalyzed the conversion.

A small quantity of unsaturated diacylglycerol (DG) sharply decreased the Ca2+ and phospholipid concentrations needed for full activation of a Ca2+-activated, phospholipid-dependent multifunctional protein kinase described earlier (Takai, Y., Kishimoto, A., Iwasa, Y., Kawahara, Y., Mori, T. and Nishizuka, Y. (1979)J.Biol.Chem.254. 3692–3695). In the presence of unsaturated DG and micromolar order of Ca2+, phosphatidylserine (PS) was most relevant with the capacity to activate the enzyme, whereas phosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol (PI) were far less effective. Phosphatidylcholine was practically inactive. It is possible, therefore, that unsaturated DG, which may be derived from PI turnover provoked by various extracellular stimulators, acts as a messenger for activating the enzyme, and that Ca2+ and various phospholipids such as PI and PS seem to play a role cooperatively in this unique receptor mechanism.

In rat brain three members of the protein kinase C family encoded by cDNAs termed delta, epsilon, and zeta were newly identified by molecular cloning and sequence analysis. The new members have a common structure that is closely related to but clearly distinct from the four members of the family previously isolated having alpha-, beta I-, beta II-, and gamma-sequences, although the zeta-cDNA available at present does not appear to contain a complete reading frame for protein kinase C. The delta-, epsilon-, and zeta-cDNAs all encode a characteristic cysteine-rich sequence and protein kinase domain sequence, both of which are highly homologous among the protein kinase C family. However, the new members lack one of the conserved regions that is present in alpha-, beta I-, beta II-, and gamma-sequences. An additional cDNA clone termed epsilon' was isolated, which is identical with epsilon-cDNA except for a short sequence at the 5'-terminal end region. The two members having delta- and epsilon-sequences were expressed in COS 7 cells, and partially purified and characterized. The enzymes having delta- and epsilon-sequences depend on phospholipid and diacylglycerol for the enzymatic activity, but their properties slightly differ from the previously known members of protein kinase C. Northern blot analysis suggests that the new members of protein kinase C exist in the brain and some other tissues.

Protein kinase C (PKC) isoforms, α, βI, and γ of cPKC subgroup, δ and ɛ of nPKC subgroup, and ζ of aPKC subgroup, were tyrosine phosphorylated in COS-7 cells in response to H 2 O 2 . These isoforms isolated from the H 2 O 2 -treated cells showed enhanced enzyme activity to various extents. The enzymes, PKC α and δ, recovered from the cells were independent of lipid cofactors for their catalytic activity. Analysis of mutated molecules of PKC δ showed that tyrosine residues, which are conserved in the catalytic domain of the PKC family, are critical for PKC activation induced by H 2 O 2 . These results suggest that PKC isoforms can be activated through tyrosine phosphorylation in a manner unrelated to receptor-coupled hydrolysis of inositol phospholipids.