Metastasis is a frequent and lethal complication of cancer. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) is a recently described lymphangiogenic factor. Increased expression of VEGF-C in primary tumours correlates with dissemination of tumour cells to regional lymph nodes. However, a direct role for VEGF-C in tumour lymphangiogenesis and subsequent metastasis has yet to be demonstrated. Here we report the establishment of transgenic mice in which VEGF-C expression, driven by the rat insulin promoter (Rip), is targeted to beta-cells of the endocrine pancreas. In contrast to wild-type mice, which lack peri-insular lymphatics, RipVEGF-C transgenics develop an extensive network of lymphatics around the islets of Langerhans. These mice were crossed with Rip1Tag2 mice, which develop pancreatic beta-cell tumours that are neither lymphangiogenic nor metastatic. Double-transgenic mice formed tumours surrounded by well developed lymphatics, which frequently contained tumour cell masses of beta-cell origin. These mice frequently developed pancreatic lymph node metastases. Our findings demonstrate that VEGF-C-induced lymphangiogenesis mediates tumour cell dissemination and the formation of lymph node metastases.

AbstractDefective function of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor ablates proteolytic regulation of hypoxia-inducible factor α subunits (HIF-1α and HIF-2α), leading to constitutive activation of hypoxia pathways in renal cell carcinoma (RCC). Here we report a comparative analysis of the functions of HIF-1α and HIF-2α in RCC and non-RCC cells. We demonstrate common patterns of HIF-α isoform transcriptional selectivity in VHL-defective RCC that show consistent and striking differences from patterns in other cell types. We also show that HIF-α isoforms display unexpected suppressive interactions in RCC cells, with enhanced expression of HIF-2α suppressing HIF-1α and vice-versa. In VHL-defective RCC cells, we demonstrate that the protumorigenic genes encoding cyclin D1, transforming growth factor alpha, and vascular endothelial growth factor respond specifically to HIF-2α and that the proapoptotic gene encoding BNip3 responds positively to HIF-1α and negatively to HIF-2α, indicating that HIF-1α and HIF-2α have contrasting properties in the biology of RCC. In keeping with this, HIF-α isoform-specific transcriptional selectivity was matched by differential effects on the growth of RCC as tumor xenografts, with HIF-1α retarding and HIF-2α enhancing tumor growth. These findings indicate that therapeutic approaches to targeting of the HIF system, at least in this setting, will need to take account of HIF isoform-specific functions. ACKNOWLEDGMENTSThis work was funded by the Wellcome Trust, Cancer Research UK, the Medical Research Council, the Urology Research Fund from Guy's Hospital, and a 6th Framework Programme at the E.U. (Euroxy Project).We thank J. Pastorek for providing the M75 antibody, K. Kranc and S. Bhattacharya for advice on retroviral work, D. Jones for help with ELISAs, and R. Peat, S. Peak, S. Johnson, and D. Watling for assistance in xenograft experiments. K.W.L. was supported by a scholarship from the Agency for Science, Technology, and Research (Singapore). R.R.R. was supported by a Rhodes scholarship.

Cellular responses to oxygen are increasingly recognized as critical in normal development and physiology, and are implicated in pathological processes. Many of these responses are mediated by the transcription factors HIF-1 and HIF-2. Their regulation occurs through oxygen-dependent proteolysis of the alpha subunits HIF-1alpha and HIF-2alpha, respectively. Both are stabilized in cell lines exposed to hypoxia, and recently HIF-1alpha was reported to be widely expressed in vivo. In contrast, regulation and sites of HIF-2alpha expression in vivo are unknown, although a specific role in endothelium was suggested. We therefore analyzed HIF-2alpha expression in control and hypoxic rats. Although HIF-2alpha was not detectable under baseline conditions, marked hypoxic induction occurred in all organs investigated, including brain, heart, lung, kidney, liver, pancreas, and intestine. Time course and amplitude of induction varied between organs. Immunohistochemistry revealed nuclear accumulation in distinct cell populations of each tissue, which were exclusively non-parenchymal in some organs (kidney, pancreas, and brain), predominantly parenchymal in others (liver and intestine) or equally distributed (myocardium). These data indicate that HIF-2 plays an important role in the transcriptional response to hypoxia in vivo, which is not confined to the vasculature and is complementary to rather than redundant with HIF-1.

The vascular endothelial growth factor (VEGF) family has recently expanded by the identification and cloning of three additional members, namely VEGF-B, VEGF-C, and VEGF-D. In this study we demonstrate that VEGF-B binds selectively to VEGF receptor-1/Flt-1. This binding can be blocked by excess VEGF, indicating that the interaction sites on the receptor are at least partially overlapping. Mutating the putative VEGF receptor-1/Flt-1 binding determinants Asp 63 , Asp 64 , and Glu 67 to alanine residues in VEGF-B reduced the affinity to VEGF receptor-1 but did not abolish binding. Mutational analysis of conserved cysteines contributing to VEGF-B dimer formation suggest a structural conservation with VEGF and platelet-derived growth factor. Proteolytic processing of the 60-kDa VEGF-B 186 dimer results in a 34-kDa dimer containing the receptor-binding epitopes. The binding of VEGF-B to its receptor on endothelial cells leads to increased expression and activity of urokinase type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor 1, suggesting a role for VEGF-B in the regulation of extracellular matrix degradation, cell adhesion, and migration.

Oxygen tensions in the kidney are heterogeneous, and their changes presumably play an important role in renal physiologic and pathophysiologic processes. A family of hypoxia-inducible transcription factors (HIF) have been identified as mediators of transcriptional responses to hypoxia, which include the regulation of erythropoietin, metabolic adaptation, vascular tone, and neoangiogenesis. In vitro , the oxygen-regulated subunits HIF-1α and -2α are expressed in inverse relationship to oxygen tensions in every cell line investigated to date. The characteristics and functional significance of the HIF response in vivo are largely unknown. High-amplification immunohistochemical analyses were used to study the expression of HIF-1α and -2α in kidneys of rats exposed to systemic hypoxia bleeding anemia, functional anemia (0.1% carbon monoxide), renal ischemia, or cobaltous chloride (which is known to mimic hypoxia). These treatments led to marked nuclear accumulation of HIF-1α and -2α in different renal cell populations. HIF-1α was mainly induced in tubular cells, including proximal segments with exposure to anemia/carbon monoxide, in distal segments with cobaltous chloride treatment, and in connecting tubules and collecting ducts with all stimuli. Staining for HIF-1α colocalized with inducible expression of the target genes heme oxygenase-1 and glucose transporter-1. HIF-2α was not expressed in tubular cells but was expressed in endothelial cells of a small subset of glomeruli and in peritubular endothelial cells and fibroblasts. The kidney demonstrates a marked potential for upregulation of HIF, but accumulation of HIF-1α and HIF-2α is selective with respect to cell type, kidney zone, and experimental conditions, with the expression patterns partly matching known oxygen profiles. The expression of HIF-2α in peritubular fibroblasts suggests a role in erythropoietin regulation.

Abstract

 Mutations in the von Hippel-Lindau (VHL) gene are associated with hereditary and sporadic clear cell renal carcinoma. VHL acts in a ubiquitin ligase complex regulating hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), but the link between this function and cancer development is unclear. Here we show that in the kidneys of patients with VHL disease, HIF activation is an early event occurring in morphologically normal single cells within the renal tubules. In comparison, dysplastic lesions, cystic lesions, and tumors showed evidence of additional mechanisms that amplify HIF activation. Detection of cells with constitutive HIF activation identified a large number of previously unrecognized foci of VHL inactivation. In proximal tubules these were almost entirely unicellular, whereas multicellular foci were almost exclusively seen in the distal nephron.